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目的:DNA损伤修复是肿瘤细胞对铂类药物耐药的重要机制,FA/BRCA通路在铂类药物所致细胞DNA损伤的修复中发挥了关键作用。本研究通过抑制人肺鳞癌细胞SK-MES-1株FA/BRCA通路上游蛋白FANCM和去泛素化蛋白USP1,观察FA/BRCA通路激活状态,探讨这些干预对化疗药物顺铂(DDP)敏感性的影响。方法:体外培养人肺鳞癌SK-MES-1细胞,按照脂质体转染试剂盒说明书介绍的程序将特异性针对FANCM和USP1基因的si RNA(FANCM-si RNA和USP1-si RNA)分别和共转染于SK-MES-1细胞株。采用蛋白质印迹法(Western Blot)测定转染后FANCM和USP1蛋白表达以验证si RNA转染效率确保转染成功;Annexin V/PI流式细胞术测定转染前后SK-MES-1细胞经10μg/ml DDP处理24h后的早期凋亡率变化;CCK-8(Cell Counting Kit-8)法测定转染前后细胞经10μg/ml DDP处理24h和48h后的生存率;蛋白质印迹法检测转染前后细胞经不同浓度梯度DDP处理后FANCD2蛋白单泛素化水平,以及免疫荧光染色检测转染前后细胞核内FANCD2核聚小体的表达状态。结果:(1)SK-MES-1细胞分别经FANCM-siRNA和USP1-siRNA转染后,与空白对照组和阴性对照组比较,FANCM蛋白和USP1蛋白表达均明显降低(两者均P<0.05),表明FANCM-si RNA转染和USP1-si RNA转染皆有效;(2)肺鳞癌细胞SK-MES-1分别转染和双转染FANCM-si RNA和USP1-si RNA后,用10μg/ml DDP处理24h,流式细胞术检测结果显示细胞的早期凋亡率明显高于未转染的细胞。但转染USP1-si RNA的细胞早期凋亡率高于转染FANCM-si RNA的细胞。USP1-si RNA和FANCM-si RNA双转染后的细胞早期凋亡率明显高于单转染FANCM-si RNA细胞的早期凋亡率(P<0.05),而与单转染USP1-si RNA细胞的早期凋亡率比较无明显差异(P>0.05)。(3)肺鳞癌细胞SK-MES-1分别转染和双转染FANCM-si RNA和USP1-si RNA后,用10μg/ml DDP分别处理24h和48h,细胞生存率和半数抑制率(IC50)明显下降,与未转染组比较均有统计学意义(P<0.05);转染USP1-si RNA细胞的生存率低于转染FANCM-si RNA的细胞(P<0.05)。USP1-si RNA和FANCM-si RNA双转染后经DDP处理24h和48h的细胞生存率和IC50明显低于单转染FANCM-si RNA细胞生存率(P<0.05),而与单转染USP1-si RNA细胞生存率比较无明显差异(P>0.05)。(4)肺鳞癌SK-MES-1细胞经FANCM-si RNA转染并经DDP处理后,以FANCD2-L/S比值所表示的FANCD2单泛素化水平下调,同时胞核内的FANCD2核聚小体表达降低,提示FA/BRCA通路上游基因FANCM沉默导致FANCD2单泛素化受抑制。转染USP1-si RNA后,DDP诱导的FANCD2单泛素化水平上调,核内FANCD2核聚小体表达增强,提示FANCD2去泛素化酶USP1被抑制后,造成单泛素化的FANCD2堆积。此外,双转染FANCM-si RNA和USP1-si RNA后,DDP诱导的细胞FANCD2单泛素化水平明显高于单转染FANCM-si RNA的细胞,但低于单转染USP1-si RNA的细胞,胞核内FANCD2核聚小体表达无明显改变,这一结果的机制如上所述。结论:沉默FANCM基因后通过抑制FA/BRCA通路FANCD2蛋白单泛素化,使得FA/BRCA通路下游蛋白不能被激活,从而无法对DDP诱导的DNA损伤实施修复;沉默USP1基因后可使FANCD2去泛素化受抑制,导致已泛素化的FANCD2在细胞内堆积,亦不能激活FA/BRCA通路下游蛋白。两者都可阻断FA/BRCA通路,抑制DNA损伤修复,导致SK-MES-1细胞对DDP的敏感性增高,值得注意的是沉默USP1基因后对DDP的增敏效应更为明显。