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番木瓜采后贮藏期间和鲜切加工后的迅速软化所导致果实的腐败变质,已成为制约其商品化生产的重要因素。在前人对番木瓜进行采后生理研究与反义ACS和ACO基因遗传转化的基础上,本文从中锁定了与番木瓜果实后熟软化密切相关的关键细胞壁水解酶β-GAL,从分子水平再次探讨了其与番木瓜果实软化的关系。通过构建含果实特异性启动子的RNAi双T-DNA植物表达载体,经由农杆菌介导转化番木瓜胚性愈伤组织,获得了共转化转基因再生植株,为进一步选育生理上可以正常成熟、且适于鲜切加工的无选择标记基因抗软化转基因番木瓜奠定基础。主要结果如下:1.建立了适于番木瓜遗传转化的体胚发生系统。以‘漳红’番木瓜组培苗的叶片和叶柄为外植体,在改良MS + 0.5 mg·L-1 KT + 1.0 mg·L-1 2, 4-D + 0.5 mg·L-1 BA + 0.1 mg·L-1 NAA + 400 mg·L-1 Glu + 30 g·L-1蔗糖的固体培养基上诱导出了胚性愈伤组织。其中,CⅡa型胚性愈伤在一定条件下能够继代增殖,并能向CⅡb型转变,CⅡb型胚性愈伤则容易发生体胚。采用两步生根法,将胚性愈伤所形成的体胚再生植株先接种于1/2 MS +0.5 mg·L-1 IBA + 1.0 g·L-1 AC + 30 g·L-1蔗糖的固体培养基中暗培养7天后,转移至1/2 MS + 1.0 g·L-1 AC + 25μM·L-1 VB12 + 30 g·L-1蔗糖的固体培养基上光照培养,生根效果最好。移栽成活率可达45%以上。2.克隆并分析了番木瓜果肉中第一类β-Gal基因。通过一对简并引物,研究番木瓜果实后熟软化过程中β-Gal基因家族表达水平的总体变化趋势,从分子水平证实了β-GALs与番木瓜果实软化的相关性,并从50%成熟度果实中克隆了果肉加速软化时表达丰度最高的第一类β-Gal基因。分离了该类β-Gal基因4501 bp的基因组序列,经比对,其共含有17个内含子,外显子部分核苷酸序列与GenBank中的cDNA只有1个碱基的差异。生物信息学分析结果表明,该番木瓜β-GAL属于糖苷水解酶超级家族42中家族35的成员,在进化过程中与拟南芥具有较近的亲缘关系,与鳄梨和北美云杉则关系较远。同时,它还具有一段定位于胞外的信号肽,推测它可能参与细胞壁的降解。3.分离了番木瓜第一类β-Gal基因启动子,并进行了初步的功能鉴定。利用反向PCR技术,分离了第一类β-Gal基因1143 bp的5’端调控序列。在线预测结果表明,该片段含有核心启动子元件TATA盒,转录起始位点在起始密码子上游-133处。同时,还发现了与如乙烯等植物激素和胁迫应答元件,根部和胚胎器官特异性元件,以及增强子区域。利用该片段取代pCAMBIA 1301载体上GUS基因前的CaMV 35S启动子,经由农杆菌EHA 105介导侵染番木瓜不同组织器官,发现其具有明显的启动子功能,为伤诱导类型,并与特定器官的发育相关。GUS活性在果肉中最强,其次为胚和根部,其它器官中则不表达。4.构建了用于番木瓜遗传转化的植物表达载体。将β-Gal基因保守区反向重复插入载体pKANNIBAL构建RNAi中间表达载体pKAN/RG。将其上发夹结构取代经改造的载体pCAMBIA 1300上hptⅡ基因,构建中间表达载体p1300-/MFRG。分离其上单T-DNA区段,与载体pCAMBIA 2301构建RNAi双T-DNA植物表达载体p2301/TTRG。将两端含有BamHⅠ和SalⅠ粘性末端的β-Gal基因启动子片段、p2301/TTRG经XbaⅠ和BamHⅠ双酶切后的大片段和p2301/TTRG经XbaⅠ和SalⅠ双酶切后的小片段相连接,构建含有果实特异性启动子的RNAi双T-DNA植物表达载体。酶切分析和PCR检测表明,p2301/TTRG和p2301/BPTTRG均被成功导入农杆菌EHA 105,可用于后续的遗传转化研究。5.开展了以携带植物表达载体p2301/TTRG的农杆菌EHA 105介导的番木瓜遗传转化方法和体系优化的研究。探索了液体振荡转化法、浸泡转化法、体胚针刺法和茎段转化对番木瓜转化效率和共转化效率的影响,以前两种方法的效果较好,以浸泡转化法的“100μmol·L-1 AS +菌液OD为0.2 +侵染20 min +共培养2 d”为本试验的最佳转化组合;“100μmol·L-1 AS +菌液OD为0.2 +侵染20 min +共培养3 d”为最佳的共转化组合。后两种方法则不太适于番木瓜的遗传转化。最终,获得了5株转基因再生植株,经PCR和Southern杂交检测结果表明,只有2株为共转化的结果,诱导了其中1株生根并移栽。6.开展了番木瓜转BPTTRG基因和转MFRG的初步研究。利用浸泡转化法,以携带植物表达载体p2301/BPTTRG和p1300-/MFRG的农杆菌EHA 105,分别侵染CⅡb型胚性愈伤组织。前者获得了经GUS染色、PCR检测和Southern杂交结果为阳性的共转化转基因番木瓜再生植株。后者从198株再生植株的62个DNA混合池中,PCR检测出了两个阳性池。进一步对混合池中的单株分别进行PCR检测,则未能成功分离出转基因植株,在不含抗生素选择压的条件下的遗传转化可能出现了嵌合体现象。以上研究获得的双T-DNA共转化的转RNAi-β-Gal基因番木瓜植株,有望通过一次有性杂交,选育无选择标记基因的抗软化转基因番木瓜,在一定程度上解决转基因食品的安全性问题。