颞下颌关节（temporomandibular joint,TMJ）是OA(osteoarthritis)发生的最常见部位之一，也是颞下颌关节紊乱病TMD的重症表现形式之一。TMJ的功能运动和生物机械力与咬合的关系相当密切，而异常咬合被认为是TMJ OA的潜在病理因素。最近我课题组分别报道了在大鼠和小鼠上下前牙上安装一种金属不良修复体导致动物单侧前牙反牙合（unilateral anterior crossbite,UAC），从而诱导出TMJ OA的病损。本研究旨在前期工作基础上进一步从从影像学（运用micro-CT）、大体观察（用体视显微镜）、组织学研究（HE染色和番红O/固绿染色）、超微结构观察（用透射电镜）以及相关基因的mRNA水平变化（用real-time PCR）等方面对TMJ OA病损的发生和发展以及性别差异等多方面对我们单侧前牙反牙合动物模型进行全面系统的评价。　　第一部分大鼠单侧前牙反牙合模型的建立和标本的收集、以及髁状突表面的大体形态学观察结果　　目的：建立单侧前牙反牙合动物模型，用体视显微镜对髁状突表面进行大体宏观观察。方法：由第四军医大学动物中心提供120只6周龄Sprague-Dawley（SD）大鼠，分别为雌性60只（体重140-160g），雄性60只（150-170g）。所有对大鼠的饲养和操作规程均得到第四军医大学伦理委员会的许可，并严格遵循其规章制度执行，按照一定的规格制作大鼠左侧上下切牙金属套筒冠，其中左下切牙的金属套筒冠有一与其长轴呈135度唇向倾斜的平面导板。这样，实验组（UAC组）大鼠左侧切牙呈反向咬合，而右侧切牙咬合正常。而对照组采用同样的处理方法和饲养条件，但不粘结左上下切牙的金属套筒冠，直至实验结束。分别在UAC手术后4、12、20周后，对这三个时间点的大鼠TMJ进行取材，用来进行micro-CT扫描、大体观察、组织化学染色、透射电镜观察以及相关基因的mRNA水平检测等。大体观察方法：将髁状突头从TMJ关节囊中脱出，剥离周围软组织，用冠剪从其髁状突颈部剪下髁状突头，立即放入0.9％生理盐水中，编上编号，马上在体视显微镜下进行观察及拍照，并按照一定的评价标准对每个髁状突进行评价。　　结果：雌雄动物的对照组髁状突软骨表面大多呈光滑连续、丰满的梭形。4周时，UAC组髁状突表面变为瘦长的梭形；12周时，UAC组髁状突表面出现轻微变形、中部出现明显的浅凹陷；而到20周时，中部的凹陷更严重，致使髁状突表面呈“葫芦状”或“8字形”的变形。　　结论：UAC使大鼠髁状突出现变形，并且这种变形随着时间的推移而加重。　　第二部分 Micro-CT对髁状突软骨下骨进行影像学研究　　目的：用来扫描、评估UAC导致大鼠髁软骨下骨的长程变化。　　方法：在髁状突软骨下骨的中部和后部选择两个圆柱体（长轴0.5mm，直径0.25mm）作为感兴趣区，在此感兴趣区内，用Mimics16.0对BV/TV（骨体积分数），BS/BV(骨表面积和骨体积之比)，Tb.Th(骨小梁厚度)、Tb.Sp（骨小梁间隙）、Tb.N（骨小梁数量）进行计算，然后取两者的平均值作为最终统计数据。　　结果：雌雄动物4、12、20周UAC组的BV/TV值均低于其各自的同龄对照组。雌雄动物UAC组4周和12周的TB.SP值均高于各自的同龄对照组。雌性动物4周和12周的BS/BV值均高于各自的同龄对照组。而雄性动物只有4周时，其UAC组BS/BV高于其对照组。雌性动物12周和20周时，UAC组的Tb.Th值均高于各自的同龄对照组，而雄性动物只有在20周时，其UAC组Tb.Th高于其对照组。雄性动物4周和12周UAC组的TB.N值均低于各自的同龄对照组。而雌性动物只有在4周时，其UAC组的TB.N数值低于其对照组。　　结论：UAC导致三个时间点实验组大鼠髁状突软骨下骨骨质丢失，但这种骨质丢失的幅度随着时间的推移而逐渐减弱。　　第三部分组织化学染色及组织学评分　　目的：用组织化学染色对TMJ进行观察和评分。　　方法：常规HE染色和番红O/固绿染色。　　结果：雌雄动物在4、12和20周UAC组其组织学评分均高于各自的同龄对照组，并且其评分随着时间的推移而增加。而无论雌雄，其4周UAC和12周对照组相比、12周UAC组和20周对照组相比，组织学评分均无统计学差异。　　结论：UAC导致大鼠TMJ髁状突评分增加，并且其增加趋势随着时间的延长而加重。UAC导致大鼠TMJ评分增加的趋势类似于提前老化。　　第四部分透射电镜对髁状突软骨进行超微结构观察　　目的：观察UAC刺激导致髁状突软骨出现的超微结果变化。　　方法：用2.5%的戊二醛和1%的四氧化锇固定髁状突软骨标本，10%EDTA脱钙，用水漂洗后，梯度乙醇脱水、氧化丙烯处理、环氧树脂812过夜。之后，在60℃烤箱中固化。用显微镜超薄切片机超薄切片处理，用乙酸铀酰和柠檬酸铅对切片进行染色后用透射电镜进行观察。　　结果：雌雄动物UAC组髁状突软骨中都出现了排列紊乱的胶原纤维和纤维间隙的扩大、软骨细胞周围钙化痕迹的增多。另外，雌性UAC组髁状突软骨增殖层细胞质中出现大量的自噬泡，并且随着时间的推移而逐渐增多。　　结论：UAC导致雌雄大鼠髁状突软骨出现胶原纤维稀疏、排列紊乱、软骨细胞周围基质钙化增强、雌性动物中自噬泡的大量出现等，这些结果显示雄性的超微结构的变化没有雌性明显。　　第五部分髁状突软骨的 mRNA水平检测　　目的：检测相关基因在UAC所致髁状突软骨退变中的变化，初步探讨TMJ OA的病理机制。　　方法：用来自于两只大鼠TMJ的髁状突软骨组织（n=2）进行RNA提取，反转后进行real-time PCR检测和分析。这样共进行三次，每次对来自两只不同大鼠TMJ髁状突软骨组织（n=2）进行RNA提取、real-time PCR检测。取三次检测结果的均值作为最终统计数据。　　结果：和各自的同时间点同龄对照相比，Aggrecan和Col2a1的mRNA水平在4、12和20周的雌雄UAC组中均呈下降趋势。在雌性UAC组中，Adamts-4和　　Adamts-5，在4周时与同时间点同龄对照相比升高，而在12周和20周时与同时间点同龄对照相比降低。而在雄性UAC组，Adamts-4和Adamts-5在4周时比同时间同龄对照相比呈升高趋势；而在12周时与同时间点同龄对照相比呈降低趋势（p=0.003，p=0.002）；但在20周时，与同时间点同龄对照相比无统计学差异。Mmp3在雌雄动物4、12和20周，其UAC组的mRNA表达量均高于各自同时间点的同龄对照。Mmp13在4周雌雄UAC组与同时间同龄对照相比呈增高趋势，在12周的雌雄UAC组与同时间的同龄对照相比呈降低趋势，在20周雌性UAC组与同时间点同龄对照相比呈降低趋势，而在雄性动物中则呈与同时间点同龄对照相比没有统计学差异。与各自的同时间同龄对照组相比，雌雄4周UAC组的Col10mRNA水平均呈增加趋势，而在12周和20周UAC组中呈减少趋势。Alp的mRNA表达水平在雌雄4周UAC组均高于各自的同时间点同龄对照组，而在12周和20周的UAC组中均低于各自同时间点的同龄对照组。与同时间点同龄对照相比，Runx2在雌雄动物4周UAC组中升高，而在12周和20周UAC中降低。　　结论：UAC引起了大鼠髁状突软骨中Aggrecan、Col2a1、Adamts-4、Adamts-5、Mmp3、Mmp13、Col10、Alp、Runx2 mRNA水平在4周、12周和20周三个时间点的变化，提示UAC引起了软骨合成代谢、分解代谢、分化等相关基因的改变，这可能是UAC引起TMJ OA的相关分子机制的缩影。