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利用胚胎干细胞(ESCs)向生殖细胞的分化在体外建立研究生殖细胞发育分化的模型,具有可重复性和可控制性,在研究生殖细胞的发生、增殖、分化及调控和治疗人类不孕不育症等方面具有重要意义。近几年,已有多篇关于ESCs在体外诱导条件下分化为原始生殖细胞(PGCs)并进一步生成成熟配子的报道。但ESCs向生殖细胞的诱导效率仍然很低。本研究筛选维甲酸(RA)浓度,睾丸提取液,睾丸细胞条件培养液,雌激素(E2)和促卵泡激素(FSH)等诱导小鼠胚胎干细胞( mESCs)向生殖细胞分化的效果,进一步利用转染pStra8-EGFP的mESCs,通过形成类胚体(EB)的方法,采用添加RA(0.2μM )、小鼠睾丸细胞条件培养液(40%)、E2(1μg/mL)和FSH(0.1 IU/mL),结合与小鼠睾丸支持细胞(Sertoli cells)共培养技术定向诱导小鼠ESCs向雄性生殖细胞分化,以建立定向分化为雄性生殖细胞的稳定体系,为研究哺乳动物雄性生殖细胞的发生及机理建立可靠的模型。1.采用悬滴培养mESCs的方法形成EB,比较了不同细胞数形成EB的质量,研究表明1200个细胞/滴形成的EB质量比800和400个细胞/滴形成的EB质量高。将第3d形成的EB,接在铺有0.1%明胶的24孔板中,10个EBs/孔,分别采用20μM、2μM、0.2μM三个RA浓度梯度和对照进行诱导。第4 d和第7 d ,RT-PCR和免疫荧光染色的结果证明,0.2μM的RA诱导mESCs分化为原始生殖细胞(PGCs)的效率明显高于其它组。第4 d和第7 d,VASA的阳性率分别为36%和52%,均为各组最高;SCP3的阳性率分别为32%和45%,也为各组最高。另外,初步的研究结果也表明睾丸细胞条件培养液,雌激素(E2)和促卵泡激素(FSH)等诱导mESCs向生殖细胞分化具有一定效果,睾丸提取液诱导效果不明显。2.将pStra8-EGFP质粒通过电转染的方法转入mESCs作为向雄性生殖细胞分化的标记,通过浓度为200μg/mL的G418筛选2 W,获得稳定转染的细胞株(ES-Stra8),其能稳定增殖,已传至22代。RT-PCR和免疫荧光染色证明ES-Stra8表达Oct4、Nanog、Sox2等多能性基因,具有自发向3胚层细胞分化的潜能。ES-Stra8制作成EB,接到经丝裂霉素C处理的支持细胞上,添加0.2μM RA、40%睾丸细胞条件培养液、1μg/mL E2和0.1 IU/mL FSH,诱导ES-Stra8向雄性生殖细胞分化。流式分选结果表明在第7 d后有1.8% GFP阳性细胞,RT-PCR和免疫荧光检测,其在RNA和蛋白两个水平上表达OCT4、VASA、SCP3、FE-J1等生殖细胞特异性标记。细胞周期检测证实处于G1期细胞明显增多,达到G1%=91.118,接近精原细胞(G1%=91.334),苯胺兰染色结果也表明细胞核发生浓缩。在第31 d,发现有类似于精子样的细胞。3. mESCs经上述诱导方法诱导7 d,用DAPI标记12 h后移植到生精缺陷模型小鼠睾丸内,4 W后采样。荧光检测、细胞培养和组织学检测证实移植细胞能够在睾丸内存活,并且移植鼠受损的曲细精管得到一定程度的修复。