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桦褐孔菌多糖(IOP)是从传统中药桦褐孔菌当中提取、分离的多糖类成分,具有广泛的生物活性。本试验室前期研究表明,IOP具有显著的体内抗弓形虫和免疫增强等功能。但对于IOP的体外抗弓形虫机制研究尚不明确。因此,本试验将对IOP对于弓形虫速殖子体外感染的RAW264.7巨噬细胞中NF-κB和MAPK两个信号通路调控机制做研究。本试验将巨噬细胞RAW264.7作为试验对象,研究IOP对弓形虫感染的RAW264.7巨噬细胞中炎症因子表达水平及基因转录水平的影响。通过检测NF-κB以及MAPK信号途径中关键性蛋白的表达,从分子免疫水平探讨IOP的抗弓形虫免疫调控机制,为IOP的研发应用提供科学依据。首先,本试验首先采用MTT法确定IOP的安全试验剂量。试验结果显示,0～180μg/mL的IOP无明显的细胞毒性作用(P>0.05)。因此,本试验拟定IOP的高、中、低组中IOP的浓度分别为100μg/mL、50 μg/mL和25 μg/mL。ELISA法检测RAW264.7各组细胞培养液上清中相关炎症因子IL-1β、IL-4、IL-6、IFN-γ及TNF-α的表达调控水平。RT-PCR方法检测RAW264.7细胞相关炎症因子及趋化因子mRNA表达。激光共聚焦法检测IOP对NF-κB信号通路中细胞核转录因子AP-1(c-jun)和 N-NF-κB p65 活性的影响。Western-blot 方法测定 IOP 对 TLR2、TLR4 及 NF-κB信号转导通路关键蛋白 p-IKKα/β、p-IκκBα、C-NF-κB p65 及 N-NF-κB p65 以及 MAPK信号通路关键蛋白p-p38、p-JNK和p-ERK磷酸化表达水平的影响。ELISA结果显示,丨OP在一定程度上抑制相关炎症因子过度表达。给药组与模型组相比,细胞上清液中细胞因子IL-1β、IL-4、IL-6、IFN-γ和TNF-αα均呈现下降趋势。RT-PCR结果显示,IOP在一定程度上呈剂量依赖性的抑制弓形虫感染RAW264.7 细胞中 IL-1β、IL-6、TNF-α 及趋化因子 MIP-1α 和 MCP-1 mRNA 的过度表达。IOP可以在细胞转录水平上调控弓形虫感染的RAW264.7细胞中细胞因子及趋化因子mRNA表达,进而调控机体的免疫反应。本试验激光共聚焦结果显示,IOP能够剂量依赖性的抑制弓形虫感染的RAW264.7细胞中细胞核转录因子AP-1(c-jun)和N-NF-κB p65从细胞质解离向核内转移,从而发挥体外抗弓形虫的作用。Western-Blot结果显示,IOP能够剂量依赖性的上调弓形虫感染的RAW264.7细胞中C-NF-κB p65 的表达,下调 TLR2、TLR4、p-IKKα/β、p-IKBα、N-NF-κB p65 以及MAPK信号通路关键蛋白p-p38、p-JNK和p-ERK蛋白的过度表达(P<0.05或P<0.01)。结果表明,IOP能够调控NF-κB信号通路中IKKα/β、IκBα、p38、JNK和ERK的过度磷酸化水平及TLR2、TLR4表达并调控NF-κB p65从胞浆向核中移位,从而发挥其抗弓形虫免疫作用。综上试验结果表明,IOP在弓形虫感染的RAW264.7巨噬细胞中表现出抗弓形虫作用。IOP通过调控NF-κB和MAPK信号转导通路中信号因子的级联作用,调节细胞因子表达水平及mRNA表达和通路中关键蛋白表达,从而发挥其体外抗弓形虫作用。