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已获共识,同种器官移植是治疗多种器官衰竭终末阶段的重要手段。近年,多种免疫调节分子的作用及其机制被深入认识,且高效基因转移载体不断被构建,极大促进了基因治疗在同种器官移植研究领域的应用。尤其在小动物实验研究中,基因治疗已被证明可有效预防和减轻排斥反应,从而延长移植物存活。移植排斥反应的实质是同种反应性T细胞识别同种抗原后发生的细胞免疫应答,其机制为:移植术后,供、受者来源的DC可迁移至受者外周免疫器官,通过直接或间接识别途径,向受者同种反应性T细胞提呈同种抗原,并使之激活,进而诱导针对同种抗原的免疫应答。因此,通过基因治疗干预DC与同种反应性T细胞间的相互作用,有可能成为防治移植排斥反应的有效策略。迄今,多数干预策略的原理是阻断同种免疫应答中DC和T细胞间的共刺激途径,使T细胞因缺乏共刺激信号而失能(anergy)或凋亡。参与T细胞活化的共刺激分子主要包括两类,即免疫球蛋白超家族(IgSF)成员和肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)成员。研究显示,单独由IgSF共刺激分子(如CD28/B7)启动的信号,并不能持续激活T细胞,也不能形成记忆性T细胞,还需TNFRSF共刺激分子参与。属于TNFRSF的T细胞共刺激分子包括OX40、4-1BB、CD27、CD30和HVEM,均属Ⅰ型跨膜蛋白。其中,CD27和HVEM组成性表达于■T细胞表面;OX40、4-1BB和CD30在T细胞识别抗原数小时后诱导性表达。4-1BB于1989年在筛选活化T细胞cDNA文库时被发现,其并不组成性表达于静止T细胞表面,而仅表达于活化CD4+T、CD8+T和NK细胞等表面。最新研究表明,4-1BB也可表达于DC、单核细胞和中性粒细胞表面。4-1BB的配体表达于活化的APC(如DC、B细胞和单核/巨噬细胞)表面。根据4-1BB与4-1BBL所分别表达的细胞类型,提示4-1BB可能参与固有免疫和适应性免疫应答的多个阶段。近期研究显示,与CD40相同,4-1BB也是参与DC活化的分子之一。通过启动4-1BB信号途径,可诱导DC产生IL-6和IL-12等,同时上调共刺激分子B7-1和B7-2表达。与CD40/CD40L信号途径的不同之处是,CD40信号的启动有赖于活化T细胞提供配体(CD40L),而启动DC表面4-1BB信号转导的配体可能来源于邻近的APC或DC自身。因此,4-1 BB的生物学功能不仅限于参与T细胞活化。研究发现:B7/CD28共刺激信号主要在T细胞活化的前期起作用,可促进T细胞增殖并维持其短期存活;4-1BB/4-1BBL信号通路主要在免疫应答后期被启动,可维持T细胞活化,并是CD8+T细胞存活和记忆性细胞形成的必需条件。免疫应答过程中,尤其在CD28分子表达缺陷或功能障碍的情况下,4-1BB/4-1BBL通路可能在提供共刺激信号中发挥极为重要的作用。上述研究进展表明:为阻断同种反应性T细胞活化和增殖,4-1BB可能是一个重要的新靶点。本课题制备4-1BBIg复制缺陷型重组腺病毒表达载体,通过转染小鼠腹部异位心脏移植模型,阻断4-1BB与其配体的相互作用,抑制同种反应性T细胞活化、增殖和效应,并观察对移植物存活时间的影响,以初步探讨其机制,为干预移植排斥提供新策略。一、小鼠4-1BB胞外段及人IgG Fc基因克隆及真核表达质粒的构建与鉴定分别从小鼠脾脏和人外周血单个核细胞中提取总RNA,借助RT-PCR技术获取编码小鼠4-1BB胞外段(4-1BBext)和人IgG Fc的cDNA,分别将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1,重组为pcDNA3.1-4-1BBext-IgG Fc。经酶切鉴定及测序分析证实,所克隆和构建的小鼠4-1 BBext-lgG Fc cDNA阅读框及连接部位序列正确,表明可溶性4-1BB胞外段与人IgG Fc融合基因(4-1BBIg)的重组真核表达质粒构建成功。二、应用AdEasy系统在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组获得携带4-1BBIg的复制缺陷型重组腺病毒将4-1BBIg融合基因从pcDNA3.1-4-1BBext-IgG Fc真核表达质粒中经酶切回收,亚克隆于穿梭载体pAdtrack-CMV;重组穿梭载体与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌细胞(BJ5183)内同源重组,获得重组腺病毒DNA质粒(pAd4-1BBIg);将线性化pAd4-1BBIg转染293包装细胞,获得重组腺病毒(Ad4-1BBIg)。其特征为:乃E1、E3区缺失的复制缺陷型重组腺病毒;外源基因插入至E1区;以CMV为启动子,以SV40polyA为加尾信号,并携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)示踪基因。三、Ad4-1BBIg重组腺病毒的鉴定及4-1BBIg融合蛋白的表达、纯化和体外生物学效应包装成功的Ad4-1BBIg重组腺病毒通过293细胞反复扩增至所需滴度,并获得大量4-1BBIg融合蛋白;借助Sephrose 4B蛋白A亲和层析柱纯化4-1BBIg融合蛋白。在进行心脏移植模型试验前,对所获得的Ad4-1BBIg重组腺病毒及其表达蛋白的生物学特性进行较全面鉴定。1.外源基因整合及重组腺病毒的遗传稳定性分析PCR鉴定表明,Ad4-1BBIg重组腺病毒及其在连续传代培养过程中,均稳定整合有4-1BBIg基因。2.外源基因的表达检测(1)荧光显微镜检测与4-1BBIg融合基因共表达的EGFP;(2)RT-PCR方法检测重组腺病毒感染的293细胞中4-1BBIg特异性mRNA,结果表明4-1 BBIg基因被有效转录;(3)ELISA检测4-1BBIg融合蛋白在293细胞中的表达,结果显示病毒感染后48~72小时所表达的融合蛋白达到峰值;(4)Western blot分析目的蛋白表达,实验结果表明重组腺病毒表达的融合蛋白可被特异性抗体所识别,分子量约43kD。3.FACS检测4-1BBIg融合蛋白与4-1BBL的结合为检测4-1BBIg融合蛋白与配体结合的能力,小鼠DC细胞系DC2.4与4-1BBIg融合蛋白作用后,用FITC标记的羊抗人IgG Fc抗体染色。FACS结果显示,84.81%的DC2.4细胞与4-1BBIg融合蛋白结合。4.4-1 BBIg融合蛋白对同种反应性T细胞增殖及细胞因子分泌的抑制作用(1)MTT法检测T细胞增殖反应:将灭活的C57BL/6鼠脾细胞和BALB/c鼠T细胞进行单向混合淋巴细胞反应。结果显示:4-1BBIg融合蛋白可显著抑制同种异基因T细胞增殖,其抑制效应呈典型的剂量依赖性。(2)CFSE标记法检测增殖指数:以C57BL/6鼠脾细胞(用丝裂霉素C处理)作为刺激细胞,BALB/c鼠脾脏T细胞作为效应细胞,用CFSE标记后进行单向混合淋巴细胞反应。结果表明:人IgG和未加入融合蛋白组的增殖指数分别为4.79和4.52;加入0.1、0.2和0.4mg/L 4-1BBIg融合蛋白后,T细胞增殖指数分别降为3.0、2.04和1.36。(3)细胞因子检测:ELISA检测结果表明,0.4mg/L的4-1BBIg融合蛋白可显著抑制同种反应性T细胞产生IL-2和IFN-γ。四、Ad4-1BBIg重组腺病毒基因治疗延长异基因小鼠心脏移植物存活时间及其机制以BALB/c小鼠为供者,C57BL/6小鼠为受者,进行腹部异位心脏移植。每天通过腹壁触摸确定移植心脏跳动,记录移植心脏存活时间,以移植心脏完全停跳作为移植排斥的标志。实验组及AdEGFP对照组分别在移植术后,通过尾静脉注射1×1 07pfu Ad4-1 BBIg和AdEGFP重组腺病毒,并设立未处理对照组。1.Ad4-1 BBIg在受鼠体内的表达借助ELISA检测移植受鼠基因治疗后体内4-1BBIg融合蛋白的表达水平。Ad4-1BBIg治疗组于转染72小时后浓度达最高(348.5±23.5ng/ml),但转染一周后受鼠血清4-1 BBIg含量很快下降。AdEGFP基因转染组未检出4-1 BBIg表达。2.Ad4-1BBIg对异基因小鼠移植心脏存活时间的影响Ad4-1BBIg基因治疗能明显延长移植心脏存活时间,实验组平均存活时间为13.25±0.34天,与AdEGFP对照组(7.75±0.21天)和未处理对照组(7.67±0.27天)相比有显著性差异(p<0.01)。3.移植心脏HE染色与对照组相比,Ad4-1BBIg治疗组心肌细胞间单个核细胞浸润明显减少,未出现毛细血管淤血、间质出血、动脉炎和静脉炎等现象。4.移植心脏细胞因子mRNA表达移植术后3d、5d、7d分别采取各组移植心脏组织,提取总RNA,借助RT-PCR技术检测GAPDH、IL-2和IFN-γ的mRNA表达水平,结果为:AdEGFP组和未处理对照组IL-2和IFN-γ的mRNA表达水平相近,差异无显著性;与上述两组相比,术后3d、5d和7d,Ad4-1BBIg治疗组IL-2和IFN-γ的mRNA表达水平明显降低,差异有显著性(p<0.05)。5.Ad4-1BBIg对受者小鼠脾脏IFN-γ分泌细胞数量的影响借助细胞内流式细胞术分别检测移植后7天各组受者小鼠脾脏IFN-Y分泌细胞的数量(每组3只小鼠),结果如下:正常小鼠脾脏CD4+和CD8+的IFN-y分泌细胞数量分别为1.78±0.31%和9.7±0.97%:Ad4-1 BBIg治疗组、AdEGFP对照组和未处理组Th1细胞(CD4+IFN-γ+)分别为4.41±0.50%、7.98±0.46%和6.07±0.80%,无明显差异;Ad4-1BBIg治疗组Tc1细胞(CD8+IFN-γ+)为13.1±1.1 3%,明显少于AdEGFP对照组(20.54±1.11%)和未处理对照组(22.31±0.61%),p<0.05。以上结果提示:Ad4-1BBIg重组腺病毒在受鼠体内可有效表达并具有抗排斥效应,其机制与减少受鼠脾脏CD8+的IFN-γ分泌细胞数量、抑制单个核细胞浸润移植物及下调移植物4-1BB和IFN-γmRNA表达有关。结论1.借助大肠杆菌BJ5183同源重组及AdEasy载体系统,成功制备携带小鼠4-1 BB胞外段和人IgG Fc融合基因的复制缺陷型重组腺病毒Ad4-1BBIg,国内外均未见相关报道。2.在成功制备Ad4-1BBIg重组腺病毒的基础上,初步探讨其干预移植排斥反应的作用及机制。结果发现:Ad4-1BBIg可抑制同种反应性T细胞增殖和细胞因子分泌、抑制CD8+的IFN-γ+细胞产生、抑制单个核细胞浸润移植物,并有效延长小鼠同种移植心脏存活时间。本课题研究成果可望为干预移植排斥反应提供新策略。