研究背景新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)指围产期窒息引起的大脑缺氧缺血性损伤,是导致新生儿死亡和长期神经系统功能障碍的重要原因[1,2]。相关研究表明,平均1000个活产新生儿中有1.5-4个患有该疾病[2,3],其中15-25%患病儿会在新生期死亡[4],而20-30%的幸存者将伴有缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)导致的永久性神经系统功能障碍性疾病,如癫痫、智力障碍和脑性瘫痪等[5],给患儿带来严重的身心压力,也给患儿的家庭造成了沉重的经济负担。目前的临床治疗主要包括高压氧、亚低温、扩张脑血管和抗自由基等,以期延缓或阻断HIBD对神经元的损伤和破坏[6,7]。但上述方法的最佳治疗时间窗短暂(数小时内),并且脑血流再通后容易发生缺血再灌注的二次损伤,治疗的效果并不理想。因此,全面深入的了解HIBD的发病机制,寻找新的治疗策略迫在眉睫。HIBD后,继发性损伤促使病情进一步发展和恶化,特别是炎症反应的过度激活,导致HIBD急性期出现的梗死灶逐渐扩大。在梗死核心周围的“缺血半暗带”区,HIBD的直接性损伤还不足以引起组织的完全坏死[8]。其组织学改变主要表现为半暗带区神经元的凋亡和小胶质细胞的活化。此外,随着继发性损伤的延续,半暗带区逐渐发展,有明显的恶化和合并成为梗死核心的风险[9]。如何避免“缺血半暗带”的恶化,恢复组织的完整性,一直是神经病学面临的最大挑战之一。作为炎症反应的“主角”,小胶质细胞在HIBD中发挥了“双刃剑”的功能。在炎症反应的初期可以促进组织的再生和恢复;但在炎症反应的中后期,由于缺血缺氧引起小胶质细胞的过度激活,其分泌大量的促炎因子如IL-1β、TNF-α、IL-6等。这些炎症因子会进一步引起神经元的凋亡,加重原发性损伤[10]。在HIBD中,小胶质细胞除了参与炎症反应的角色之外,还伴有自噬的表现。自噬与炎症反应是密切相关的两个过程。有研究表明,适度的细胞自噬对于受损细胞的修复具有积极的作用,但是当自噬达到一定的阈值时,细胞将会死亡[11]。那么在新生儿HIE中,自噬到底发挥了有益还是有害的作用,其是否可以作为治疗HIE的新靶点,相关的基础和临床研究仍然十分有限。因此,如何保留小胶质细胞在炎症反应中的有益作用,而抑制其过度活化,以及如何建立有利的方法干预自噬的激活水平,是HIBD临床治疗策略能否成功的关键。奥拉西坦(Oxiracetam,ORC)能够选择性地作用在海马区和大脑皮层,可以改善慢性脑功能缺陷和脑缺氧等症状[12],恢复受损的神经功能,是一种神经营养素药物。ORC能通过血脑屏障,在脑部缺血的时候激活糖酵解,提高脑组织对糖的利用效率以及能量代谢,促进大脑皮层的神经功能恢复[13]。一些临床实践[14-16]表明,ORC在阿尔茨海默病、脑梗死和脑中风等方面获得了非常好的效果,主要应用在脑损伤、神经功能缺陷、记忆力与智力不全等方面。而且ORC没有中枢兴奋性,没有直接的血管活动,这表明它的副作用很小,安全度高。近几年有报道称,将ORC试用于HIE的临床治疗,能够抑制炎症因子的分泌水平,也可以抑制神经细胞的凋亡,减轻脑梗死,缓解神经系统功能缺陷,恢复认知功能[17,18]。然而,其治疗HIBD的病理和分子机制仍不清楚,特别是ORC在脑损伤继发炎症反应和自噬中到底发挥何种作用,其又如何影响激活的小胶质细胞和凋亡神经元之间的相互作用尚未见报道;此外ORC是否能够减轻或者逆转“缺血半暗带”损伤仍然需要进一步研究。研究目的采用Rice-Vannucci法建立HIBD模型,探究ORC在新生小鼠HIBD后神经损伤中的保护作用及机制。研究方法1.建立模型采用Rice-Vannucci法建立HIBD模型模拟人类新生儿HIE:取出生后第7 d的昆明小鼠建立HIBD模型,小鼠用2%的异氟烷吸入性麻醉;固定小鼠并消毒皮肤;颈部正中切开皮肤后剥离右侧颈总动脉,用4-0缝合线结扎;将伤口缝合,碘伏擦拭颈部皮肤;放回母鼠身边,1h后把小鼠放在37℃密闭缺氧箱内,输入8%氧气和92%氮气的混合气体,缺氧90min。在这个条件下形成的组织病理学改变与人类新生儿HIBD相似。如果HIBD造模后3d右脑出现明显的水肿,则成功建立了模型。假手术(Sham)组小鼠麻醉后,只是把右侧颈总动脉暴露出来,不进行结扎和缺氧处理。2.实验分组及干预方法将7d新生昆明小鼠随机分为4组:假手术组+生理盐水(Sham)、模型组+生理盐水(HIBD)、模型组+低剂量ORC保护组(HIBD+1mg/kg ORC)、模型组+高剂量ORC保护组(HIBD+4mg/kg ORC),手术后6h第一次给予药物处理,然后分别在HIBD后24h、48h、72h腹腔给药一次。3.检测方法新生小鼠HIBD后72h取脑组织,利用反转录—聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、Luminex、免疫荧光技术、Western blot技术等实验方法检测ORC对HIBD后损伤侧(右侧)皮层中自噬、细胞凋亡和炎症因子的影响。利用透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)技术检测ORC对HIBD后自噬小体的影响。利用翻身反射、负趋地反射和悬崖回避实验,检测小鼠运动协调性和神经反射能力。研究结果1.HIBD后3 d,小鼠右侧脑组织损伤的检测结果1.1.脑组织含水量变化HIBD后3 d,与Sham组相比,HIBD组小鼠大脑右半球出现明显的组织水肿,并且含水量显著增加;ORC处理后,小鼠脑水肿程度明显降低,脑组织含水量降低;而且ORC的疗效成剂量依赖性。1.2.TTC染色显示与Sham组相比,HIBD组出现明显的脑梗死;而ORC治疗组显著降低了脑梗死的面积。1.3.Nissl染色显示Sham组右侧的脑组织结构清晰而且完整;与Sham组相比,HIBD组右侧组织损失严重,损伤明显;ORC治疗组右侧脑组织与HIBD组相比,有显著的改善。1.4.MRI检测显示与Sham组相比较,HIBD组梗死灶的DWI图像信号更高;而ORC治疗组DWI图像信号降低。2.行为学检测结果2.1.翻身实验与Sham组相比,HIBD组小鼠翻转后四肢着地的时间延长;ORC处理组小鼠四肢着地的时间明显低于HIBD组。2.2.负趋地反射与Sham组相比,HIBD组小鼠转身180度并开始往上爬的时间延长;ORC处理组小鼠反射时间较HIBD组明显缩短。2.3.悬崖回避与Sham组相比,HIBD组小鼠离开桌边1cm的时间延长;与HIBD组相比,ORC处理组悬崖回避时间明显减少。3.细胞凋亡指标的检测结果3.1.TUNEL染色显示HIBD组的TUNEL阳性细胞数明显高于Sham组;与HIBD组相比,ORC治疗组TUNEL阳性细胞数明显降低。3.2.Western blot 检测显示与Sham组相比,HIBD组Cleaved caspase-3/β-actin的比值显著提高;与HIBD组相比,ORC治疗组Cleaved caspase-3/β-actin的比值显著下降。3.3.Cleaved caspase-3/NeuN免疫荧光技术染色显示与Sham组相比,HIBD组Cleaved caspase-3/NeuN阳性细胞数明显增加;与HIBD组相比,ORC治疗组显著降低了 Cleaved caspase-3/NeuN阳性细胞数。4.小胶质细胞相关指标的检测结果4.1.Western blot检测小胶质细胞增殖变化显示HIBD组的Iba1表达水平明显高于Sham组;而ORC治疗后可以降低Iba1表达水平。4.2.Luminex法检测脑组织中炎性介质显示与Sham组相比,HIBD组的促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6的分泌显著增加;ORC治疗组剂量依赖性的逆转了 HIBD引起的促炎因子水平;而抗炎因子IL-4、IL-10在HIBD后呈上升趋势,并且ORC治疗后增强了其分泌水平。4.3.Cleaved caspase-3/Iba1免疫荧光技术染色显示HIBD组的Cleaved Caspase-3/Iba1阳性细胞数明显高于Sham组;与HIBD组相比,ORC治疗组的Cleaved Caspase-3/Iba1阳性细胞数明显降低,缺血半暗带也显著减小;而小胶质细胞的吞噬作用明显增强。5.细胞自噬指标的检测结果5.1.RT-PCR检测显示与Sham组相比,HIBD组LC3B、Atg5、Beclin1的mRNA表达水平升高;ORC治疗后mRNA表达水平进一步升高。5.2.Beclin-1/Iba1免疫荧光技术染色显示与Sham组相比,HIBD组Beclin-1阳性细胞数明显增加,Iba1阳性细胞数明显增加;与HIBD组相比,ORC治疗组进一步升高了 Beclin-1阳性细胞数,而使Iba1 阳性细胞数明显降低。LC3-B/Iba1免疫荧光染色结果,同Beclin-1/Iba1免疫荧光染色结果。5.3.电子显微镜检测自噬小体显示与Sham组相比,HIBD组自噬小体数增加;ORC治疗组进一步增加了自噬小体的个数。6.体外实验检测结果6.1.体外Luminex法检测BV-2细胞中炎性因子的分泌显示OGD组中促炎性因子IL-1β、TNF-α和IL-6的表达增加,抑炎因子IL-4和IL-10的表达也增加;而加入ORC之后,促炎细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6显著降低,而抗炎因子IL-4、IL-10进一步增加,与体内实验一致。6.2.CCK-8实验分析显示与阴性对照组(NC)相比,OGD处理后小胶质细胞BV-2的增殖活性增加,神经元细胞HT-22的增值活性降低;加入ORC后,可以剂量依赖性地使BV-2细胞活性降低,HT-22细胞的增值活性增加;加入ORC并用BV-2细胞上清液处理后HT-22细胞的增值活性进一步增加。研究结论1.在HIBD急性期,ORC可以减轻脑水肿,减少脑梗死面积,降低脑损伤。2.ORC有效地改善HIBD后小鼠的行为缺陷。3.ORC可以抑制HIBD诱导的神经元细胞凋亡。4.ORC可以抑制小胶质细胞的增殖,调节小胶质细胞的分泌特性,将小胶质细胞的神经毒性作用转化为神经保护作用;并且可以增加小胶质细胞的吞噬作用,减少缺血半暗带的面积。5.ORC可以增强细胞的自噬。6.ORC通过调节小胶质细胞更好的发挥对神经元的保护作用。