第一部分人原发性肝细胞癌中肿瘤相关性巨噬细胞CD206的表达分析目的:使用肝癌组织芯片研究肿瘤相关性巨噬细胞(TAM)标记物CD206的表达与原发性肝癌(HCC)预后的关系并分析其临床特点。方法:选取并收集手术时间于2010年1月-2011年9月,随访时间截止至2013年9月,共随访2-3.7年的原发性肝细胞癌患者共90例,采集病史,获取包含性别、年龄、肝功能、肿瘤分期等完整临床数据,并于术后将肝癌内及相应癌旁组织标本,制作成10*18共180点微阵列组织芯片(癌内及癌旁组织各1点)。免疫组织化学(IHC)检测组织芯片中肿瘤相关性巨噬细胞标记物CD206在肝癌内及对应癌旁组织的阳性表达情况,使用Kaplan-Meier(log-rank检验)法,COX回归分析了解患者生存率与CD206的表达高低及各临床指标的相关性。结果:组织芯片结果表明CD206在癌内的表达水平相较于癌旁显著为高(P<0.05),生存分析结果表明,癌内CD206高表达者较CD206低表达者生存率显著为低(P=0.008),而癌旁组织中CD206的表达高低与患者生存率无显著差异(P=0.772)。COX回归分析提示病理分级(III级,HR=1.449,P=0.043),肿瘤TNM分期(III/IV期,HR=2.117,P=0.013),性别(男性,HR=3.581,P=0.019),甲胎蛋白AFP(>200μg/L,HR=2.518,p=0.037)及癌内CD206的表达(高表达,HR=2.371,P=0.036)是患者的独立预后危险因素。结论:与TAM密切相关的甘露糖受体CD206在人原发性肝细胞肝癌组织中整体呈高表达,各病例对应的癌旁组织CD206表达相较癌内为低。癌内TAM CD206的高表达是与患者预后密切相关的独立危险因素,这为我们后续干预CD206治疗HCC提供了理论依据。第二部分诱导构建稳定细胞表型的肿瘤相关性巨噬细胞并鉴定目的:使用小鼠RAW264.7巨噬细胞系诱导构建稳定表型的肿瘤相关性巨噬细胞,并通过分子生物学手段进行鉴定。方法:RAW264.7为小鼠单核巨噬细胞,源于小鼠血液系统恶性肿瘤,是肿瘤相关性巨噬细胞(TAM,或M2)研究中常用细胞系。使用2.5μg/ml的LPS刺激RAW264.7细胞2小时,然后换完全培养基继续培养48小时,使其向M1型转变;使用10ng/ml的IL-4因子干预细胞48小时,诱导其向M2型巨噬细胞转变。诱导后的M1及M2型巨噬细胞经由流式细胞术分析F4/80,CD16/32,CD206的表达,PCR分析cd206,arg-1,inos,nf-κb1基因的表达、Western Blot检测NOS2及Arg-1蛋白的表达差异。结果:经过LPS诱导后的小鼠RAW264.7巨噬细胞高表达i NOS(NOS2),CD16/32,NF-κb1,呈现M1巨噬细胞表型;IL-4作用后的RAW264.7细胞高表达F4/80,CD206及Arg-1,呈现M2表型。结论:成功诱导建立不同表型的小鼠RAW264.7细胞,其中M2表型的巨噬细胞高表达CD206及Arg-1。这与TAM的特征相符,为后续实验打下良好基础。第三部分氯化钆(Gd Cl3)抑制肿瘤相关性巨噬细胞CD206的表达作用及相关机制研究目的:从体外细胞及体内动物实验多角度证实镧系化合物氯化钆(Gd Cl3)能够通过影响CD206的表达从而影响TAM功能,从而抑制小鼠肝癌的恶性进展。方法:配制不同浓度的Gd Cl3溶液作用RAW264.7细胞,通过CCK8实验明确Gd Cl3作用于细胞的IC10浓度;于IC10浓度下的Gd Cl3干预巨噬细胞,使用流式细胞学,免疫细胞化学,PCR,Western Blot观察并验证Gd Cl3对RAW264.7细胞CD206的抑制作用;使用cd206 RNAi抑制M2巨噬细胞CD206的表达,与Gd Cl3干预后的M2巨噬细胞分别与小鼠Hepa1-6肝癌细胞建立共培养体系,同对照组比较,探索Hepa1-6细胞在侵袭力及肿瘤上皮间质化(EMT)水平变化。使用N-亚硝基乙二胺(DEN)诱导BALB/c幼鼠发生原发性肝癌,并于肿瘤形成过程中给予小鼠注射Gd Cl3,于不同时间点获取肝脏组织及血清标本,分析Gd Cl3干预后小鼠肝脏CD206的表达变化,结合分析小鼠肝癌的生长动力学参数(肿瘤大小、体积等)、小鼠肝功指标、小鼠生存率等,综合判断分析Gd Cl3的抗癌效果及应用安全性。结果:Gd Cl3抑制RAW264.7细胞的IC10浓度为0.069μg/μl。M2型RAW264.7在IC10浓度下的Gd Cl3干预后,其CD206基因及蛋白表达即可出现显著下调。稳定下调CD206的M2型巨噬细胞与小鼠肝癌Hepa1-6细胞共培养,与未下调CD206的M2型巨噬细胞对照组相比较,Hepa1-6细胞侵袭力降低,肿瘤上皮间质化程度减弱。DEN成功诱导小鼠HCC,使用Gd Cl3长期干预小鼠,其CD206表达受到显著抑制,HCC发展减缓,小鼠整体生存率上升,Gd Cl3长期应用安全。结论:Gd Cl3能显著降低M2型RAW264.7细胞及BALB/c小鼠肝癌巨噬细胞CD206的表达,并导致肿瘤恶性程度减低。动物实验证实长期用药可行,无显著生物毒性。我们证实了Gd Cl3能够成为抗TAM的肝癌潜在治疗药物,值得进一步深入研究及推广。