第一部分机械牵张A549细胞对细胞活性和穿透素3表达的影响研究背景与目的大量资料证实了呼吸机所致肺损伤(VILI)与机械牵张应力有关,推测其可能机制是机械牵张对肺细胞的直接刺激触发、激活或启动细胞的牵张敏感基因高表达,其效应蛋白-细胞因子、炎症介质等大量产生,从而引发一系列的生物学反应,造成不同程度的生物学损伤。穿透素-3(PTX3)是一种急性期反应蛋白,也是一种炎症标志物,在炎症级联反应中均起着重要作用,并参与了机械牵张刺激引起的炎症反应过程,且它们基因启动子序列中均含有牵张反应元件,因而我们推测PTX3可能属于牵张敏感基因。本研究拟选择人肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549为研究对象,从细胞力学的角度,研究A549在体外周期性机械牵张作用下细胞凋亡和细胞因子分泌的情况,以期为VILI发生机制提供新的理论依据,并为从细胞水平研究VILI提供一个合适模型。同时以该细胞模型为基础在细胞水平观察体外机械牵张对A549细胞PTX3表达的影响。方法本研究采用美国Flexercell公司生产的细胞柔性基底加载装置FX4000T,该系统是通过一个真空泵抽吸特制的柔性细胞培养膜,形成负压而使培养膜拉伸应变,从而使黏附生长在膜上的细胞受到张力的作用,模拟机械通气对肺泡Ⅱ型上皮细胞的力学刺激,细胞所受力的大小正比于培养膜的牵拉幅度即应变率(%),加载程序由FX 4000计算机软件自动控制。对体外培养的A549细胞进行周期性牵张,观察不同机械力和不同牵张时间对细胞的影响。根据不同的处理方式分为静止对照组(C组)和机械牵张组(A组:6%应变率;B组:20%应变率),A组和B组其他加载方案均为:频率0.3Hz,周期性波形为方波,加载时间为1h、2h、4h和6h)。静止对照组:应用“Flexstop”,即一个橡胶塞塞在BioFlex培养板的下面,阻止真空抽吸柔性细胞培养膜。采用Annexin V/PI检测细胞凋亡活性,应用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜进行检测,透射电子显微镜检测和Hoechst33258单染法荧光显微镜观察凋亡细胞核的形态变化。同时应用ELISA法检测A549细胞细胞因子TNF-α的分泌。用real-time RT-PCR检测肺泡上皮细胞PTX3 mRNA表达,Western blot检测PTX3蛋白水平。结果与C组相比,牵张1h以上B组A549凋亡和死亡细胞百分比显著增加(p<0.01),而A组无显著差异(p>0.05),其差异主要是由于早期凋亡和晚期凋亡引起,而死亡细胞百分比没有显著差异(p>0.05)。B组呈时间依赖性地引起A549细胞凋亡,同时也促进细胞因子TNF-α分泌。与C组相比,B组细胞PTX3 mRNA表达和蛋白产生呈时间依赖性增加,B组被牵张2h引起PTX3 mRNA和蛋白表达显著增加,分别增加6.25倍和2.58倍(p<0.01),而A组细胞PTX3基因的表达没有影响。结论体外过度机械牵张肺泡Ⅱ型上皮细胞A549引起细胞凋亡和细胞因子TNF-α的分泌,并促进了PTX3表达,这可能在细胞力学水平为VILI提供了实验依据,同时也为后面从细胞水平研究VILI的发病机制提供了一个可行的模型。第二部分有效干扰A549细胞穿透素3表达的siRNA的筛选研究背景与目的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术作为特异抑制基因表达的重要手段,已被广泛用于基因表达调控和基因功能的研究及基因治疗。其基本原理是通过是21-23个核苷酸的小片段,即siRNA特异性识别其互补mRNA,促使其降解,使相关基因处于转录后基因沉默,从而使细胞表现出特定基因缺失的表型。目前制备siRNA的方法有体外化学合成、体外转录、体内表达载体合成等,其中体外化学合成具有方便简单的特点。基于上述考虑,本研究旨在筛选有效抑制PTX3表达的体外化学合成的siRNA,从而为进一步探索其功能,并作为某些疾病的治疗手段提供理论依据。方法采用体外化学合成的方法,合成针对PTX3的siRNA各3对、阳性对照、阴性对照和荧光对照FAM-siRNA各1对,用脂质体2000转染A549细胞,用real-time PCR及Western-blot检测PTX3 mRNA和蛋白表达的水平。并转染荧光标记对照FAM-siRNA后,应用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测转染效率。结果脂质体2000将siRNA转染A549细胞的效率为89.18%±3.26%。与空白对照组相比,3对PTX3 siRNA均有效序列显著抑制了PTX3 mRNA和蛋白的表达(P<0.01),其中针对PTX3最有效siRNA能将PTX3 mRNA抑制到3.41%,PTX3蛋白抑制到4.94%。而阴性对照组PTX3 mRNA和蛋白的表达均无显著差别(P>0.05)。结论化学合成的siRNA体外应用脂质体2000能高效转染A549,并筛选最有效干扰目的PTX3基因的siRNA,为进一步探索目的基因的功能提供理论依据。第三部分干扰穿透素3表达对机械牵张引起A549细胞活性改变的影响目的研究有效干扰PTX3基因表达对机械牵张引起A549细胞活性改变以及细胞因子释放的影响,探讨其在VILI中的可能作用。方法体外培养于包被胶原基底膜collagenⅠ的BioFlex六孔培养板的人肺泡上皮细胞A549,随机分为空白对照组、静止对照组、牵张组、RNAi组、RNAi+牵张组。空白对照为未给任何干预正常培养细胞;静止对照组应用“Flexstop”阻止牵张;牵张组采用FX4000T细胞应变加载系统周期性牵张细胞,其方案为:应变率为20%,频率为0.3Hz,周期性波形为方波,加载时间为4h; RNAi组应用lipofectamineTM2000分别转染特异靶向PTX3的siRNA;RNAi+牵张组于牵张前12h转染特异靶向PTX3的siRNA。利用real time RT-PCR法检测A549细胞PTX3 mRNA表达的变化;Western blot检测分泌PTX3蛋白;Annexin V流式细胞术检测A549细胞凋亡;ELISA法检测培养基上清中细胞因子TNF-α水平。结果与静止对照组相比,牵张组A549细胞PTX3基因和蛋白的表达显著上调,牵张组PTX3mRNA增加7.397±0.276倍(P<0.01),牵张组和静止对照组PTX3蛋白分别为0.647±0.019和1.590±0.060(P<0.01)。而与牵张组相比, RNAi+牵张组细胞PTX3 mRNA和蛋白表达显著抑制。与静止对照组相比,牵张组早期凋亡和晚期凋亡细胞百分比显著增加;而与牵张组相比,RNAi+牵张组成活细胞百分比明显增加(85.377%±1.395%和93.727%±0.492%,P<0.01),凋亡细胞百分比明显降低。结论周期性机械牵张可通过上调人肺泡上皮细胞PTX3基因和蛋白表达,导致肺泡上皮细胞凋亡增加和过度炎症反应,这一现象可能与VILI的发病机制有关。PTX3作为肺泡上皮细胞上表达的机械牵张敏感基因,从而积极参与了VILI的发病机制。第四部大潮气量机械通气大鼠肺部穿透素3的表达变化研究背景与目的呼吸机所致肺损伤(VILI)是机械通气的严重并发症之一。据统计,有22%～39%进行机械通气病人会发生VILI,死亡率高达15%～30%,严重影响患者预后。大潮气量机械通气时机械牵张应力作为一种炎症前期刺激,能通过特定的信号通路激起炎症级联反应,引起VILI。PTX3是新型的促炎症因子,在炎症级联反应中均起着重要作用,细胞水平研究结果显示,过度机械牵张能显著上调其表达,且基因启动子序列中均含有牵张反应元件,因而我们推测PTX3作为牵张敏感基因,可能在VILI的发病机制中起着重要作用。本实验拟研究大潮气量机械通气对大鼠肺部PTX3表达的影响。方法48只健康成年雄性SD大鼠随机分成正常对照组(C组,n=16,保持正常自主呼吸)、保护性机械通气组(PV组,n=16,潮气量Vt:6ml/kg,PEEP=3～5cm H2O,呼吸频率为70次/分)、大潮气量机械通气组(HV组,n=16,Vt:20ml/kg,PEEP=0),呼吸频率为20次/分。其余通气参数均一致,即吸呼之比为1∶2 ,吸氧浓度FiO2为35%。颈动脉和颈内静脉切开置管,行监测、标本采集和液体及麻醉药的输注。持续检测HR、ECG、有创动脉血压(ABP)、直肠温度量监测。间断进行血气分析,计算氧合指数。机械通气4h后处死大鼠。(1)HE染色光学显微镜下观察各组肺组织病理学变化;(2)检测肺组织湿/干重比值(W/D);(3)检测肺泡灌洗液和血清中蛋白计算肺通透指数(LPI),ELISA法检测肺组织匀浆和肺泡灌洗液中TNF-α;(4)测定肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性;(5)TUNEL法检测肺细胞的凋亡;(6)real-time PCR检测大鼠的肺组织中PTX3基因mRNA的表达水平;(7)免疫组化法检测肺组织PTX3蛋白的表达;(8)Western Blot检测肺组织PTX3蛋白的含量。结果(一)PV组与C组相比,肺损伤各项指标无显著改变。HV组通气4h PaO2显著降低(P < 0.05),肺组织LPI、W/D和MPO活性均显著增加(P < 0.05),组织病理学检测表现急性炎性损伤性改变。HV组大鼠肺组织匀浆和肺泡灌洗液中TNF-α含量显著大于C组和PV组(P < 0.01),而C组与PV组无显著差异(P > 0.05)。TUNEL法检测可见肺细胞凋亡改变。(二)与C组相比,HV组通气4h后PTX3基因mRNA和蛋白表达均显著升高,PTX3基因mRNA和蛋白分别增加3.493倍和3.799倍;而PV组PTX3基因mRNA和蛋白表达均无显著改变(P>0.05)。结论大潮气量机械通气能导致肺损伤,而且显著上调了PTX3基因mRNA和蛋白表达水平,这可能与VILI的发生密切相关。