20世纪中期以来,肺癌的发病率在多数国家呈明显上升趋势,且逐年不断增高,其发病率及死亡率占各种恶性肿瘤的首位。Ki-67是一种目前应用最广泛的增殖细胞标记之一,对协助诊断、分析预后及指导治疗都具有重要的意义。关于Ki-67与肺癌组织学类型、分化程度、pTNM分期、淋巴结转移状态、年龄及吸烟的关系目前意见不一,且都是从定性角度进行研究。关于Ki-67与肺癌预后的关系也有很多不同意见,所以,Ki-67与肺癌预后的关系也一直是研究热点。因此,深入研究Ki-67与肺癌预后的关系具有重要现实意义。p53突变普遍存在于肺癌癌变的过程中,其作为抑癌基因倍受关注。关于p53基因突变或P53蛋白表达与肺癌的生物学行为及临床病理特征的相关性,目前还存在争议。有报道认为p53与Ki-67的表达呈正相关,但是,也有文献报道二者呈负相关。那么,Ki-67和p53之间是否存在一致的关系?Ki-67和p53的联合检测及分析在肺癌病理学诊断和预后分析中的价值是否会更大?肺癌中Ki-67和p53表达的量化特点及基于量化改变的变化规律又如何?要回答这些问题,必须结合临床病理诊断和随访及Ki-67和p53的表达进行诊断定量病理学研究和预后分析。为此,我们设计了本项研究。目的和意义本课题旨在观察Ki-67和p53蛋白在肺癌组织、正常成人肺组织和成人肺部良性病变肺组织中的定量表达情况,从蛋白水平揭示肺癌组织中Ki-67和p53的量化特点,并且探讨Ki-67和p53蛋白在肺癌的诊断和分型中的临床应用价值以及二者联合检测对于肺癌预后的预示作用。材料和方法一、Ki-67和p53蛋白在肺癌表达中的定量分析实验材料和分组：组织来自南方医院病理科2000-2009年间病理活检及尸检标本。患者术前未接受放疗或化疗。样本含量如下：正常成人肺组18例,成人肺部良性病变组50例,肺癌组161例,按照1999年WHO/IASLC肺癌组织病理学分级分类法,将肺癌组进一步分为：鳞癌组73例,腺癌组59例,腺鳞癌组14例,大细胞癌组5例,小细胞癌组10例。肺癌并有淋巴结转移104例,肺癌尚无淋巴结转移灶57例。肺癌并有远处转移43例,肺癌尚无远处转移118例。中央型肺癌48例,周围型肺癌113例。TNM分期Ⅰ期34例,Ⅱ期29例,Ⅲ期55例,Ⅳ期43例。实验方法：采用免疫组织化学技术检测Ki-67和p53蛋白在不同类型肺组织中的表达情况,应用Leica Q500 MC图像分析系统测试Ki-67和p53蛋白的阳性单位(PU)值,分析不同类型肺组织中Ki-67和p53蛋白表达强度的变化规律及与肺癌临床和病理特征之间的关系。统计学分析：应用SPSS13.0统计分析软件进行处理。各组实验数据以平均值±标准差(x±s)表示。应用Spearman法分析Ki-67与p53蛋白表达之间的相关关系,并对二者进行Kappa一致性分析。经方差齐性检验知各样本总体方差不齐,多个样本均数间的比较采用单向方差分析(One-way ANOVA)近似F检验Welch法,组间多重比较采用Dunnett’s T3检验。按患者性别、吸烟史、肺尘埃情况、肿瘤大体类型、肺癌分化程度、淋巴结转移、远处转移情况及肺癌TNM分期分组,采用两独立样本t检验(总体方差齐)或两独立样本t′检验(总体方差不齐)比较两组患者PU值。二、Ki-67和p53蛋白在肺癌诊断中的意义分析实验材料和分组：详见一(Ki-67和p53蛋白在肺癌表达中的定量分析),与其不同之处在于,本章肺癌组168例,较第一章多7例,为其他病理类型肺癌(例如：不典型类癌、梭形细胞癌等)。实验方法：应用免疫组织化学技术和Leica Q500 MC图像分析系统定量检测肺癌组织、正常成年人肺组织、肺部良性病变肺组织中Ki-67和p53蛋白的表达情况,结合诊断试验评估的方法确定Ki-67和p53的诊断截断值,揭示其在肺癌诊断和鉴别诊断中的辅助作用。统计学分析：应用SPSS13.0统计分析软件进行处理。应用诊断试验四格表求得不同的截断值和诊断参数,并结合受试者工作特征曲线(receiver operation characteristic curve, ROC)分析确定Ki-67和p53蛋白的最佳截断值。三、Ki-67和p53蛋白对肺癌预后的生存分析实验材料：本研究为回顾性研究,收集南方医院2000年—2005年符合诊断与纳入标准的患者161例：其中有详细完整的临床随访资料的患者132例,平均年龄56.77±9.78(34～73岁)；132例中男性104例,平均年龄57.23±9.69(34～73岁)；女性28例,平均年龄55.07±10.10(35～73岁)；剩余29例失访,作为删失数据处理。实验方法：收集肺癌患者临床和随访资料,根据Ki-67和p53在肺癌组织中免疫组化的表达情况采用半定量判定的方法,将肺癌患者分为四组：A组(Ki-67高表达／p53高表达)、B组(Ki-67高表达／p53低表达)、C组(Ki-67低表达／p53高表达)、D组(Ki-67低表达／p53低表达),探讨四组之间患者生存时间的差异；并采用单因素分析和COX回归模型的方法揭示各种因素对患者生存时间的影响。统计学分析：应用SPSS13.0统计分析软件进行处理。各组实验数据以平均值±标准差(x±s)表示。应用Spearman法分析Ki-67、p53阳性细胞百分比与肺癌患者生存时间之间的关系。采用Kaplan-Meier方法进行中位生存时间的计算,显著性检验采用Log rank法,组间1年～5年生存率的比较采用R×C资料x2检验,对预后因素进行COX回归分析。生存期计算自确诊之日至死亡或末次随访时间。不同生存时间段Ki-67及p53的PU值的比较：经方差齐性检验知各样本总体方差齐,多个样本间的比较采用单向方差分析。不同组别(A、B、C、D四组)Ki-67及p53的PU值的比较：Ki-67组经方差齐性检验知各样本总体方差齐(F=1.856,P=0.0140),多个样本间的比较采用单向方差分析,组间多重比较采用LSD检验；p53经方差齐性检验知各样本总体方差不齐(F=3.313,P=0.022),多个样本间的比较采用单向方差分析,组间多重比较采用Dunnett’s T3检验。结果一、Ki-67和p53蛋白在肺癌表达中的定量分析1、正常成人肺组织和肺部良性病变肺组织Ki-67的PU值小于肺鳞癌、肺腺癌、肺腺鳞癌和肺小细胞癌癌细胞胞核Ki-67的PU值(P=0.000)；正常成人肺组织和肺部良性病变肺组织Ki-67的PU值小于肺大细胞癌癌细胞胞核Ki-67的PU值(P=0.028)；正常成人肺组织Ki-67的PU值与肺部良性病变肺组织Ki-67的PU值基本相同,差异无统计学意义(P=0.991)；肺鳞癌、肺腺癌、肺腺鳞癌、肺大细胞癌与肺小细胞癌癌细胞胞核Ki-67的PU值基本相同,差异无统计学意义(P>0.05)。正常成人肺组织和肺部良性病变肺组织p53的PU值小于肺鳞癌、肺腺癌癌细胞胞核p53的PU值(P=0.000)；正常成人肺组织和肺部良性病变肺组织p53的PU值小于肺腺鳞癌、肺大细胞癌和肺小细胞癌癌细胞胞核p53的PU值,但差异没有统计学意义(P>0.05)；正常成人肺组织p53的PU值与肺部良性病变肺组织p53的PU值基本相同,差异无统计学意义(P=0.995)；肺鳞癌、肺腺癌、肺腺鳞癌、肺大细胞癌与肺小细胞癌癌细胞胞核p53的PU值基本相同,差异无统计学意义(P>0.05)。2、肺癌癌细胞核Ki-67和p53的PU值均与患者性别(P=0.603；P=0.317)、年龄(P=0.996；P=0.301)、吸烟史(P=0.110；P=0.328)、肺尘埃情况(P=0.301；P=0.070)、肿瘤大体类型(P=0.366；P=0.343)、肺癌的分化程度(鳞癌：P=0.605；P=0.066；腺癌：P=0.879；P=0.867)、淋巴结转移情况(P=0.658；P=0.797)、远处转移情况(P=0.550；P=0.714)和TNM分期(P=0.420；P=0.737)无关。3、Ki-67和p53蛋白表达之间无相关性(r=0.119,P=0.132)。Ki-67和p53一致性分析结果显示：Kappa=0.11,表明二者一致性差。二、Ki-67和p53蛋白在肺癌诊断中的意义分析1、应用受试者工作特征曲线(receiver operation characteristic curve, ROC)分析限定Ki-67蛋白的截断值,当选择肺组织Ki-67的正常截断值x+4s,即16.09时,检测的灵敏度、特异度和准确度均处于较好水平。此时ROC值为0.96。进一步对免疫组化检测方法进行标准化诊断试验分析评价,得灵敏度(Se)为91.07%,特异度(Sp)为100.00%,标准化阳性预告值(SPPV)为100.00%,标准化阴性预告值(SNPV)为91.80%,标准化准确度(SAc)为95.54%,标准化错诊率(SWDR)为4.46%。2、应用ROC曲线分析限定p53蛋白的截断值,当选择肺组织p53的正常截断值为x+4s,即17.20时,检测的灵敏度、特异度和准确度均处于中等偏差水平。此时ROC值为0.62。进一步对免疫组化检测方法进行标准化诊断试验分析评价,得灵敏度(Se)为52.38%,特异度(Sp)为100%,标准化阳性预告值(SPPV)为100%,标准化阴性预告值(SNPV)为67.74%,标准化准确度(SAc)为76.19%,标准化错诊率(SWDR)为23.81%。3、Ki-67和p53系列试验的灵敏度是50.00%,特异度是100%；Ki-67和p53平行试验的灵敏度是93.45%,特异度是100%。三、Ki-67和p53蛋白对肺癌预后的生存分析1、肺癌患者临床和病理特征对患者预后影响的单因素分析,结果显示：淋巴结转移、TNM分期、Ki-67和p53联合检测这些因素对患者预后的生存时间有影响,差异均有统计学意义(P<0.05)。其他因素对患者预后的生存时间没有显著影响,差异均没有统计学意义(P>0.05)。2、Ki-67细胞阳性率与肺癌患者生存时间的相关性分析,结果显示：r=-0.196,P=0.024,表明二者之间相关性有统计学意义,但相关性关系并不密切。p53细胞阳性率与肺癌患者生存时间的相关性分析,结果显示：r=0.004,P=0.967,表明二者之间没有相关性。3、Ki-67和p53联合检测肺癌A(Ki-67高表达／p53高表达)、B(Ki-67高表达／p53低表达)、C(Ki-67低表达／p53高表达)、D(Ki-67低表达／p53低表达)四组患者生存期的变化：A组的中位生存时间为24月,1年、2年、3年、4年及5年生存率分别为90.0%、60.0%、40.0%、30.0%及26.7%；B组的中位生存时间为16月,1年、2年、3年、4年及5年生存率分别为74.4%、44.2%、20.9%、14.0%及11.6%；C组的中位生存时间为22月,1年、2年、3年、4年及5年生存率分别为70.0%、50.0%、40.0%、20.0%及20.0%；D组的中位生存时间为24月,1年、2年、3年、4年及5年生存率分别为89.7%、69.2%、48.7%、46.2%及35.9%。A、B、C、D四组生存时间差异有统计学意义(P=0.023)；其中,A组和D组较B组生存时间长,差异有统计学意义(P=0.033和P=0.006)。D组4年生存率明显优于A、B、C三组,B组4年生存率最低,差异有统计学意义(P=0.010)。四组间1年、2年、3年及5年生存率差异无统计学意义(P值分别为0.091、0.127、0.063和0.072)。4、Ki-67和p53联合检测非小细胞肺癌A(Ki-67高表达／p53高表达)、B(Ki-67高表达／p53低表达)、C(Ki-67低表达／p53高表达)、D(Ki-67低表达／p53低表达)四组患者生存期的变化：A组的中位生存时间为30月,1年、2年、3年、4年及5年生存率分别为96.2%、61.5%、46.2%、34.6%及30.8%；B组的中位生存时间为16月,1年、2年、3年、4年及5年生存率分别为77.5%、45.0%、22.5%、15.0%及12.5%；C组的中位生存时间为24月,1年、2年、3年、4年及5年生存率分别为73.7%、52.6%、42.1%、21.1%及21.1%；D组的中位生存时间为34月,1年、2年、3年、4年及5年生存率分别为92.1%、71.1%、52.6%、50.0%及39.5%。A、B、C、D四组生存时间差异有统计学意义(P=0.024)；其中,A组和D组较B组生存时间长,差异有统计学意义(P=0.019和P=0.011)。D组1年、3年、4年及5年生存率明显优于A、B、C三组,B组1年、3年、4年及5年生存率最低,差异有统计学意义(P值分别为0.049、0.044、0.007、0.048)。A、B、C、D四组间2年生存率差异无统计学意义(P=0.123)。5、肺癌患者中没有淋巴结转移者是46例,中位生存时间是34个月,有淋巴结转移者是86例,中位生存时间是21个月,没有淋巴结转移者的生存时间较有淋巴结转移者长,差异有统计学意义(P=0.005). TNMⅠ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期的患者分别是26例、24例、44例和38例,中位生存时间分别为60个月、18个月、20个月和24个月,差异有统计学意义(P=0.001)。6、(1)将患者生存时间分为<12m、12～23m、24～35m、36～47m、48～59m、≥60m六组,Ki-67及p53六组PU值的比较均没有统计学意义(P>0.05)。(2)Ki-67和p53 A(Ki-67高／p53高)、B(Ki-67高／p53低)、C(Ki-67低／p53高)、D(Ki-67低／p53低)四组间PU值比较：四组整体而言组间差异有统计学意义(F=12.071,P=0.000；F=68.137,P=0.000)。7、对性别、年龄、吸烟史、肺尘埃情况、大体类型、组织学类型、分化程度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期、Ki-67及p53的独立检测、Ki-67和p53的联合检测进行Cox回归分析,结果显示TNM分期为影响生存的独立预后因素(P=0.030),提示：表明TNM的分期越大,生存时间越短。结论一、本研究从定量角度证实：Ki-67和p53蛋白在肺癌组织中的表达高于其在正常成人肺组织与肺部良性病变肺组织中的表达；正常成人肺组织和肺部良性病变肺组织的表达基本相同；肺癌各组织学类型之间的表达基本相同。Ki-67和p53与患者性别、吸烟史、肺尘埃情况、肿瘤大体类型、分化程度、淋巴结转移和远处转移情况以及TNM分期无关。Ki-67和p53蛋白表达之间无相关性,并且二者表达的一致性差。二、对于肺癌的诊断判别,可以以Ki-67的PU值16.09作为诊断阈值,当PU值≥16.09时,判别为肺癌,其诊断肺癌的灵敏度是91.07%,特异度是100%；可以以p53的PU值17.20作为诊断阂值,当PU值≥17.20时,判别为肺癌,其诊断肺癌的灵敏度是52.38%,特异度是100%。Ki-67和p53系列试验的灵敏度是50.00%,特异度是100%；Ki-67和p53平行试验的灵敏度是93.45%,特异度是100%。平行试验诊断价值最高。三、Ki-67和p53蛋白的联合检测较独立检测对肺癌的预后有更好的预示作用。联合检测Ki-67和p53的表达,1年～5年生存率的高低分别为：Ki-67低表达／p53低表达组(34月)>Ki-67高表达／p53高表达组(24月)>Ki-67低表达／p53高表达组(22月)>Ki-67高表达／p53低表达组(16月)。