景天三七器官工厂化培养关键技术研究

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景天三七(Sedum aizoon L.),通常以根或整株入药,拥有止血补心、养心安神等功效。通过植物组织培养技术建立景天三七不定根培养体系,其培养物可以作为大田栽培及野生资源的替代品或有力补充,对于解决景天三七资源的突出问题具有重要意义。本研究采用景天三七为实验材料,对愈伤组织和不定根的诱导及生长条件进行优化分析,建立了景天三七不定根分层组合的高效诱导体系;并对不定根进行了液体小试和生物反应器的放大,同时对培养物中花色苷积累、抗氧化性及抑菌性等进行了相关研究。主要结果如下:(1)景天三七不定根的诱导主要包括脱分化形成胚性愈伤组织和再分化形成不定根等主要过程。实验建立了基于叶片为外植体,在培养基中辅以2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)2.0 mg/L和6-BA(6-苄氨基嘌呤)0.5 mg/L的愈伤组织高效诱导体系;增殖培养基中辅以NAA(萘乙酸)0.1 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.1 mg/L,愈伤组织的鲜重增长量高,相对生长速率达到0.0631,且质地紧密,适合作为不定根诱导的出发材料。同时发现,愈伤组织在生长过程符合“S”型生长曲线,最佳的生长周期为2830 d左右。(2)培养基中植物激素配比和营养成分的种类对不定根诱导率影响最为显著。结果表明,选择营养成分较为多元的MS(Murashige&Skoog)作为基础培养基,附加IBA(吲哚丁酸)4.0 mg/L+KT(激动素)1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L,NO3-/NH4+比例为5:1(总含量为60 mmol/L)时,能够满足不定根生长需求,诱导率为98.32%。同时,分层组合培养基具有植物激素的缓释、无需转接和生长周期短等优点。(3)不定根在液体摇床培养条件下,转速为110 rpm时更加有利于不定根的生长,不定根数量较为密集,生长速度快,增殖倍数为13.66;当进行扩大培养时,通气率为0.167 m3/(m3·min)时其生长较为迅速。(4)通过对不同培养时间愈伤组织中主要花色成分进行测定,花色苷含量最高为(584.4±8.12)μg/g,类胡萝卜素含量最高为(9.98±0.21)mg/g,类黄酮含量最高为(3.66±0.25)mg/g。(5)经过抗氧化实验,愈伤组织和不定根提取物对DPPH和羟自由基具有一定的抗氧化活性,不定根及愈伤组织提取物对羟自由基清除能力较为接近,分别为(77.35±2.05)%和(83.14±2.34)%;在对DPPH的清除能力上,景天三七不定根提取物清除率高达(91.09±2.12)%,愈伤组织清除率为(72.15±2.14)%。(6)抑菌实验结果表明,景天三七不定根的提取液具有一定的抑菌作用;不定根提取物对试验大肠杆菌、灿烂弧菌的MIC为0.0625 g/mL金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌以及铜绿假单胞菌的MIC为0.125 g/mL。综上所述,本研究建立了愈伤组织-不定根诱导与固体增殖-不定根液体培养-3 L生物反应器放大中试等技术与工艺流程,并对愈伤组织和不定根培养物进行了花青素积累及抑菌研究。本研究实现了景天三七不定根的高效诱导及增殖培养,为后续进一步规模化培养和最终商业化生产奠定了基础。
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