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苯酚是一种非常重要的有机化工原料,广泛应用于石油化工和生物医药领域。目前,全球97%以上的苯酚是通过异丙苯法生产的。异丙苯法具有污染严重、危险性高等缺点。以绿色环保的微生物发酵法生产苯酚具有广阔的应用前景。本研究通过克隆苯酚合成基因,质粒过表达苯酚合成途径中的关键酶,构建出了新型的苯酚生物合成途径并鉴定出了该途径中的关键酶。然后通过整合ycl操纵子、定点突变并调控aroG基因、整合ubiC基因和调控ycl操纵子,得到了苯酚产量较高的大肠杆菌细胞工厂。首先,将来源于E. coli W (ATCC 9637)的对羟基苯甲酸脱羧酶基因簇yclBCD克隆到表达载体pTrc99A-M上,构建出了苯酚生物合成途径；然后将编码3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合酶和分支酸裂解酶(UbiC)的基因aroGfbr(突变后的aroG基因)和ubiC分别克隆到表达载体pACYC184-M上,并检测了过表达这两个酶对苯酚产量的影响。研究发现这两个酶都是苯酚合成途径中的关键酶,过表达之后分别使苯酚产量提高了5.8和68.2倍。为了构建遗传稳定的苯酚生产菌株,将ycl操纵子整合到野生型大肠杆菌ATCC8739染色体的idhA(编码乳酸脱氢酶)位点,得到了苯酚产量为1.7 mg/L的起始菌株；然后定点突变aroG基因,并进行染色体水平的调控,解除DAHP合酶的反馈抑制,使苯酚产量提高了4.3倍；随后在pflB(编码丙酮酸甲酸裂解酶)位点整合了ATCC8739的ubiC基因(记做p-ubiC基因),并使用不同强度启动子调控p-ubiC基因来提高对羟基苯甲酸(pHBA)的供给,效果最好的菌株的苯酚产量提高了19.2倍；之后使用不同强度启动子调控ycl操纵子,得到苯酚产量最高的重组菌株Phe009,苯酚产量又提高了36%,产量为249.9 mg/L。最后,以三丁酸甘油酯为苯酚萃取剂,将Phe009进行双相高细胞密度发酵,苯酚产量达到了9.5 g/L,转化率为0.061 g苯酚儋葡萄糖。通过整合对羟基苯甲酸脱羧酶、解除DAHP合酶的反馈抑制、提高前体物质pHBA的供给和提高脱羧酶的活性,得到了一株遗传稳定、苯酚产量较高的菌株,相对于起始菌株,苯酚产量提高了147倍。通过双相高密度发酵,苯酚产量达到了9.5 g/L,迄今为止,这是运用代谢工程手段改造大肠杆菌获得的苯酚产量最高的菌株。