论文部分内容阅读
根据2021年《CA:ACancerJournalforClinicians》发布的2020全球癌症统计报告显示:前列腺癌是112个国家中最常见的恶性肿瘤，仅2020年全球就有140万新发病例和37.5万死亡病例，在男性肿瘤中其致死率仅次于肺癌位列第二。近年来，随着高脂肪食物摄入量增加、人口老龄化、前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)筛查的普及、前列腺穿刺活检技术的广泛使用及超声、CT、MRI等影像学检查水平的提高，前列腺癌在我国的发病率呈逐年升高趋势，年增长率高达8.92％，年死亡率高达13.37％，因此，如何进行前列腺癌的精准诊断和治疗是亟待解决的重大医学问题。
肿瘤的发生和进展是一个非常复杂的过程，因此寻找在肿瘤进展中发挥重要作用的基因和信号通路并对此进行干预显得尤为重要。雄激素和雄激素受体(androgen receptor, AR)信号通路在前列腺癌进展中发挥重要作用。多年来，研究者发现通过直接靶向配体(雄激素)、AR、AR共调节因子或其他可促进雄激素信号通路活化的分子可有效抑制前列腺癌进展。目前，临床上用于治疗晚期前列腺癌的新一代药物包括抑制雄激素合成的阿比特龙和靶向AR配体结合区域抑制AR活性的恩杂鲁胺(enzalutamide，Enz)等。虽然这些药物对延缓疾病的进展具有一定效果，但患者在使用上述药物一段时间后会出现不同程度的临床耐药。因此，深入研究AR信号通路在晚期前列腺癌进展中的调节机制并识别新颖治疗靶点，可以为前列腺癌患者提供新的治疗策略。
肿瘤微环境(tumor microenviroment，TME)被认为是肿瘤细胞赖以生存的土壤，在促进肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭中发挥重要作用。活性氧(reactive oxidative stress，ROS)可通过调控TME在肿瘤进展中发挥重要作用。一方面，异常升高的ROS可通过激活MAPK、ERK、JUN等癌基因信号通路或通过引起DNA突变，促进肿瘤的发生和进展，已有文献报道在前列腺癌中ROS通过激活AR信号通路促进去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer, CRPC)进展，但对此相关机制的研究并不深入;另一方面，过高水平的ROS可引起细胞死亡或严重损伤，此时肿瘤细胞会启动抗氧化相关机制来维持细胞稳态，促进细胞存活，这在肿瘤的早期发展阶段尤为重要。ROS水平升高、氧化还原稳态失调以及抗氧化分子表达上调构成了肿瘤细胞的众多特征之一。硫氧还原蛋白家族作为ROS清除系统中的成员，在多种组织中均有表达，并且表达量与肿瘤进展呈正相关。我们课题组前期研究显示硫氧还原蛋白-5(thioredoxin domain containing protein 5，TXNDC5)通过激活AR信号通路促进CRPC进展;Samaranayake等人证实TRX1在CRPC组织中表达升高，并且TRX1抑制剂通过诱导ROS产生进而促进AR蛋白表达，以上结果提示TRX蛋白家族成员在ROS促AR信号通路激活中发挥作用，但具体机制有待进一步研究。硫氧还原蛋白包含蛋白9(thioredoxin domain containing protein 9，TXNDC9)又称APACD或PhLP3，是硫氧还原蛋白家族中的一员，由226个氨基酸组成，其C端包含硫氧还原蛋白样结构域。有研究显示在肝癌中TXNDC9通过激活MYC相关信号通路促进肝癌进展;此外，FOXA1结合于TXDNC9的启动子区诱导其在肝癌中高表达。而MYC和FOXA1均在前列腺癌进展中发挥着非常重要的作用。以上研究结果提示TXNDC9可能参与了前列腺癌的进展。
第一部分TXNDC9是ROS激活AR信号通路的重要调节组分
雄激素通过与AR结合增强其转录活性，调节前列腺癌细胞的生长、分化和凋亡。大部分前列腺癌的进展过程包括:前列腺上皮内瘤变→雄激素依赖性前列腺癌→CRPC这三个阶段。AR信号通路在前列腺癌进展过程中发挥了至关重要的作用。CRPC为前列腺癌的终末阶段，目前临床上治疗CRPC的药物包括抑制雄激素合成的阿比特龙、抑制AR活化的恩杂鲁胺以及放疗和化疗药物，虽然上述药物可延长患者的总生存期，但是在治疗一段时间后会出现不同程度的耐药性，然而对于发生耐药的患者，临床上仍无积极有效的治疗策略，此期患者预后较差。因此深入探究AR信号通路在CRPC进展中的作用机制并寻找新的作用靶点，可为前列腺癌患者带来新的希望。目前，ROS在肿瘤进展中的作用受到越来越多的关注，有研究表明ROS通过激活AR信号通路促进前列腺癌的进展，但具体机制有待进一步研究。因此，解析ROS在前列腺癌进展中的分子作用机制可为前列腺癌的分子靶向治疗提供理论支持。TRX家族成员在调控细胞的氧化还原反应中发挥重要作用，并且在多种肿瘤组织中高表达。Chen等人报道在肝癌中TXNDC9通过激活MYC相关信号通路促进肝癌进展，而MYC在促前列腺癌进展中的作用已被证实。以上结果提示我们TXDNC9可能参与了前列腺癌的进展，为验证这一假设，本部分以前列腺癌临床标本和前列腺癌细胞系作为研究对象，分别在临床病理和体内外水平进行研究探讨，并获得如下结果:
1.硫氧还原蛋白家族中TXNDC9对活性氧反应敏感:我们首先采用生物信息学方法分析了前列腺癌GEO数据库中tunicamycin(TM)(一种可诱导ROS产生的内质网应激诱导剂)对TRX家族中各成员表达的影响，结果显示，在前列腺癌细胞系PC3中，随着TM处理时间延长，TRX家族中多个成员的表达量均有升高趋势，其中以TXNDC9升高最明显且具有时间依赖性。以上结果表明TXNDC9与ROS之间存在相关性。
2.在前列腺癌细胞中TXNDC9为ROS反应性基因:为进一步验证ROS与TXNDC9之间的相关性，我们采用LNCaP(AR+，雄激素敏感性)细胞和PC3(AR-，雄激素非依赖性)细胞进行实验。qRT-PCR结果显示:随着TM处理时间延长，硫氧还原蛋白家族中所有成员mRNA表达量均升高，其中以TXNDC9升高最为显著;并且TXNDC9在LNCaP细胞中表达量明显高于PC3细胞。Westernblot结果显示在LNCaP、VCaP和C4-2B细胞中，TM和thapsigargin(TG，另一种ROS诱导剂)均能促进TXNDC9的表达且该效应具有时间和剂量依赖性。以上结果表明，在前列腺癌细胞中TXNDC9为ROS反应性基因并且可能与AR之间存在相关性。
3.TXNDC9在前列腺癌组织中高表达:为了探讨TXNDC9在前列腺癌组织中的表达特点，我们首先使用前列腺癌GEO数据库分析了TXNDC9与前列腺癌分期和分级之间的相关性，结果显示，与良性增生性前列腺组织相比，TXNDC9mRNA表达水平在CRPC组织中明显上调，并且与肿瘤的病理学分期和Gleason评分呈正相关;其次我们使用免疫组织化学技术分析了TXNDC9在良性前列腺组织、中分化及高分化前列腺癌组织以及CRPC组织中的表达水平，结果显示TXNDC9蛋白表达与Gleason评分呈正相关，其中在CRPC组织中升高最为显著。
4.TXNDC9促进前列腺癌细胞增殖和肿瘤形成:为了探讨TXNDC9在前列腺癌细胞中的生物学功能，我们构建了靶向TXNDC9的siRNA和过表达质粒。细胞增殖和细胞凋亡实验证实，与对照组相比较，TXNDC9低表达抑制LNCaP细胞增殖、促进细胞凋亡;相反，TXNDC9高表达促进细胞增殖、抑制细胞凋亡。本研究还发现TXNDC9能部分拮抗ROS所引起的细胞增殖减弱和凋亡增强。裸鼠皮下成瘤实验进一步证实，稳定过表达TXNDC9可促进肿瘤生长。
5.TXNDC9促进雄激素剥夺条件下前列腺癌细胞的增殖和肿瘤形成:雄激素剥夺治疗(androgen deprivation therapy，ADT)是前列腺癌的经典治疗手段。为探讨TXNDC9在雄激素剥夺前后的表达和作用，我们首先在LNCaP细胞中检测了雄激素剥夺条件下TXNDC9蛋白水平的表达，结果显示随着雄激素剥夺时间延长TXNDC9的表达量呈升高趋势;细胞增殖实验显示，过表达TXNDC9后明显促进了雄激素剥夺条件下LNCaP细胞的增殖。裸鼠皮下成瘤实验进一步证实，过表达TXNDC9后促进了去势条件下裸鼠肿瘤的生长。以上结果显示TXNDC9可促进雄激素剥夺条件下前列腺癌细胞生长和肿瘤形成。
6.TXNDC9促进AR信号通路活化:上述结果提示TXNDC9与AR之间存在相关性。为进一步阐述两者之间的关系，我们在沉默TXNDC9表达后检测了前列腺癌LNCaP细胞AR蛋白的表达变化。结果显示在LNCaP细胞中过表达或沉默TXNDC9后促进或抑制了AR蛋白水平的表达。其次，在LNCaP细胞中干扰TXNDC9表达后，给予雄激素刺激，可明显抑制雄激素诱导的AR入核以及AR靶基因的表达。
7.TXNDC9参与ROS对AR信号通路的活化:文献报道ROS通过多种途径激活AR信号通路，那么TXNDC9作为在前列腺癌中高表达的ROS反应性基因，在ROS激活的AR信号通路中是否发挥作用呢？Westernblot结果显示在LNCaP细胞中沉默TXNDC9表达后，ROS所诱导的AR蛋白水平升高受到抑制。核浆分离和qRT-PCR实验证实，沉默TXNDC9表达后由ROS所致的AR入核和AR靶基因高表达均受到抑制。
综上所述，TXNDC9在前列腺癌组织中表达升高并且扮演癌基因的角色;TXNDC9为ROS反应性基因，参与了ROS促AR信号通路的激活。
第二部分TXNDC9通过促进PRDX1蛋白的稳定性激活AR信号通路并促进前列腺癌的进展
本研究前期工作已证实TXNDC9在前列腺癌组织中高表达并且与肿瘤进展呈正相关，TXNDC9在ROS激活AR信号通路中发挥重要影响。因此，进一步探讨TXNDC9激活AR信号通路的机制，有助于深刻理解ROS对AR信号通路的作用。本部分研究通过GST-pulldown实验联合质谱分析，系统筛选与TXNDC9相互作用的蛋白，并通过体内外实验，从多层面解析了TXNDC9对AR信号通路的作用机制，取得了以下结果:
1.GST-pulldown联合质谱分析筛选出与TXNDC9相互作用的蛋白:采用GST-pulldown联合质谱分析技术，以GST-TXNDC9为诱饵寻找与其结合的蛋白，结果显示与AR信号通路具有密切相关性的过氧化物还原酶1(peroxiredoxin 1，PRDX1)和小鼠双微体基因2(murine double minute2，MDM2)均与TXNDC9存在结合。免疫共沉淀实验证实在LNCaP和VCaP细胞中TXNDC9与PRDX1和MDM2存在内源性结合。
2.ROS条件下PRDX1增加AR蛋白的稳定性:PRDX1是过氧化物酶家族中的一员，在过氧化物的清除中发挥重要作用。有研究指出在ROS和热休克条件下PRDX1以二聚体的形式主要发挥分子伴侣作用，通过与AR结合促进AR蛋白的稳定性，此时其抗氧化作用消失。本研究中，我们首先检测了ROS条件下PRDX1的抗氧化活性，结果显示在基础状态下PRDX1发挥抗氧化作用，但是在TM刺激条件下其抗氧化作用消失。并且Co-IP实验显示:LNCaP、VCaP和C4-2B细胞在ROS刺激条件下PRDX1与TXNDC9结合减弱但是与AR结合增强。Westernblot结果显示，在ROS条件下PRDX1通过增强AR蛋白的稳定性促进AR蛋白及其靶基因的表达。
3.TXNDC9负向调控MDM2蛋白的表达:在质谱结果中我们还鉴别出MDM2与TXNDC9存在结合。Co-IP结果显示，在ROS条件下，LNCaP、VCaP和C4-2B细胞中MDM2与AR结合减少，与TXNDC9结合增加。其次，我们检测了ROS和TXNDC9对MDM2表达的影响，结果显示，ROS和TXNDC9均抑制MDM2蛋白表达;同时ROS对MDM2的抑制作用受到TXNDC9的负向调控。以上结果提示，TXNDC9通过与MDM2结合进而抑制了MDM2与AR结合，促进了MDM2蛋白的降解和AR蛋白的稳定性。
4.PRDX1调控AR与MDM2的结合:为进一步探讨PRDX1、MDM2和TXNDC9之间的相关性，我们在LNCaP、VCaP和C4-2B细胞中分别沉默PRDX1和MDM2表达后，分别以MDM2和PRDX1为诱饵抗体，使用Co-IP分别检测了MDM2/AR和PRDX1/AR之间的结合。结果显示与对照组相比，在ROS条件下，沉默PRDX1表达后MDM2与AR结合增多。但是在沉默MDM2表达后，PRDX1与AR结合没有明显变化，以上结果提示PRDX1影响了MDM2与AR的结合。那么MDM2、PRDX1和AR之间是否存在竞争性结合呢？我们在LNCaP和C4-2B细胞转入不同浓度的Flag-PRDX1质粒后，以AR为诱饵抗体，使用Co-IP检测AR与PRDX1和MDM2的结合。结果显示，随着PRDX1质粒浓度升高，PRDX1与AR结合增多，但与MDM2结合减少。以上结果表明，PRDX1与MDM2竞争性结合AR。
5.PRDX1抑制剂抑制前列腺癌细胞增殖和肿瘤形成:依据以上结果，我们假设TXNDC9以PRDX1依赖性的形式促进前列腺癌进展，PRDX1可能是新颖的治疗靶标。因此，我们使用PRDX1抑制剂ConoidinA(CoA)进行了进一步的体内外实验。qRT-PCR结果显示，在LNCaP细胞中，CoA明显抑制了TXNDC9所引起的AR靶基因(PSA和KLK2)表达。裸鼠皮下成瘤实验结果显示，与对照组相比较，CoA明显抑制TXNDC9高表达组裸鼠肿瘤体积的增长。更为重要的是，在CRPC细胞模型C4-2B细胞中，与单独加入Enz或CoA比较，两者联合用药后抑制肿瘤细胞增殖的效率更为显著。上述结果提示AR信号通路抑制剂和PRDX1抑制剂的联合使用可能延缓前列腺癌的进展，尤其对TXNDC9高表达的前列腺癌更为明显。
综上所述，TXNDC9是ROS激活AR信号通路的重要调节分子。在ROS条件下，TXNDC9表达水平升高，一方面TXNDC9与PRDX1解离，促进PRDX1与AR结合，增强AR蛋白的稳定性;另一方面TXNDC9与MDM2的结合，促进了MDM2蛋白的降解，抑制了MDM2与AR的结合。两者协同促进AR信号通路活化。上述研究丰富了ROS激活AR信号通路的作用机制，为前列腺癌的干预治疗提供了新的靶点。
肿瘤的发生和进展是一个非常复杂的过程，因此寻找在肿瘤进展中发挥重要作用的基因和信号通路并对此进行干预显得尤为重要。雄激素和雄激素受体(androgen receptor, AR)信号通路在前列腺癌进展中发挥重要作用。多年来，研究者发现通过直接靶向配体(雄激素)、AR、AR共调节因子或其他可促进雄激素信号通路活化的分子可有效抑制前列腺癌进展。目前，临床上用于治疗晚期前列腺癌的新一代药物包括抑制雄激素合成的阿比特龙和靶向AR配体结合区域抑制AR活性的恩杂鲁胺(enzalutamide，Enz)等。虽然这些药物对延缓疾病的进展具有一定效果，但患者在使用上述药物一段时间后会出现不同程度的临床耐药。因此，深入研究AR信号通路在晚期前列腺癌进展中的调节机制并识别新颖治疗靶点，可以为前列腺癌患者提供新的治疗策略。
肿瘤微环境(tumor microenviroment，TME)被认为是肿瘤细胞赖以生存的土壤，在促进肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭中发挥重要作用。活性氧(reactive oxidative stress，ROS)可通过调控TME在肿瘤进展中发挥重要作用。一方面，异常升高的ROS可通过激活MAPK、ERK、JUN等癌基因信号通路或通过引起DNA突变，促进肿瘤的发生和进展，已有文献报道在前列腺癌中ROS通过激活AR信号通路促进去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer, CRPC)进展，但对此相关机制的研究并不深入;另一方面，过高水平的ROS可引起细胞死亡或严重损伤，此时肿瘤细胞会启动抗氧化相关机制来维持细胞稳态，促进细胞存活，这在肿瘤的早期发展阶段尤为重要。ROS水平升高、氧化还原稳态失调以及抗氧化分子表达上调构成了肿瘤细胞的众多特征之一。硫氧还原蛋白家族作为ROS清除系统中的成员，在多种组织中均有表达，并且表达量与肿瘤进展呈正相关。我们课题组前期研究显示硫氧还原蛋白-5(thioredoxin domain containing protein 5，TXNDC5)通过激活AR信号通路促进CRPC进展;Samaranayake等人证实TRX1在CRPC组织中表达升高，并且TRX1抑制剂通过诱导ROS产生进而促进AR蛋白表达，以上结果提示TRX蛋白家族成员在ROS促AR信号通路激活中发挥作用，但具体机制有待进一步研究。硫氧还原蛋白包含蛋白9(thioredoxin domain containing protein 9，TXNDC9)又称APACD或PhLP3，是硫氧还原蛋白家族中的一员，由226个氨基酸组成，其C端包含硫氧还原蛋白样结构域。有研究显示在肝癌中TXNDC9通过激活MYC相关信号通路促进肝癌进展;此外，FOXA1结合于TXDNC9的启动子区诱导其在肝癌中高表达。而MYC和FOXA1均在前列腺癌进展中发挥着非常重要的作用。以上研究结果提示TXNDC9可能参与了前列腺癌的进展。
第一部分TXNDC9是ROS激活AR信号通路的重要调节组分
雄激素通过与AR结合增强其转录活性，调节前列腺癌细胞的生长、分化和凋亡。大部分前列腺癌的进展过程包括:前列腺上皮内瘤变→雄激素依赖性前列腺癌→CRPC这三个阶段。AR信号通路在前列腺癌进展过程中发挥了至关重要的作用。CRPC为前列腺癌的终末阶段，目前临床上治疗CRPC的药物包括抑制雄激素合成的阿比特龙、抑制AR活化的恩杂鲁胺以及放疗和化疗药物，虽然上述药物可延长患者的总生存期，但是在治疗一段时间后会出现不同程度的耐药性，然而对于发生耐药的患者，临床上仍无积极有效的治疗策略，此期患者预后较差。因此深入探究AR信号通路在CRPC进展中的作用机制并寻找新的作用靶点，可为前列腺癌患者带来新的希望。目前，ROS在肿瘤进展中的作用受到越来越多的关注，有研究表明ROS通过激活AR信号通路促进前列腺癌的进展，但具体机制有待进一步研究。因此，解析ROS在前列腺癌进展中的分子作用机制可为前列腺癌的分子靶向治疗提供理论支持。TRX家族成员在调控细胞的氧化还原反应中发挥重要作用，并且在多种肿瘤组织中高表达。Chen等人报道在肝癌中TXNDC9通过激活MYC相关信号通路促进肝癌进展，而MYC在促前列腺癌进展中的作用已被证实。以上结果提示我们TXDNC9可能参与了前列腺癌的进展，为验证这一假设，本部分以前列腺癌临床标本和前列腺癌细胞系作为研究对象，分别在临床病理和体内外水平进行研究探讨，并获得如下结果:
1.硫氧还原蛋白家族中TXNDC9对活性氧反应敏感:我们首先采用生物信息学方法分析了前列腺癌GEO数据库中tunicamycin(TM)(一种可诱导ROS产生的内质网应激诱导剂)对TRX家族中各成员表达的影响，结果显示，在前列腺癌细胞系PC3中，随着TM处理时间延长，TRX家族中多个成员的表达量均有升高趋势，其中以TXNDC9升高最明显且具有时间依赖性。以上结果表明TXNDC9与ROS之间存在相关性。
2.在前列腺癌细胞中TXNDC9为ROS反应性基因:为进一步验证ROS与TXNDC9之间的相关性，我们采用LNCaP(AR+，雄激素敏感性)细胞和PC3(AR-，雄激素非依赖性)细胞进行实验。qRT-PCR结果显示:随着TM处理时间延长，硫氧还原蛋白家族中所有成员mRNA表达量均升高，其中以TXNDC9升高最为显著;并且TXNDC9在LNCaP细胞中表达量明显高于PC3细胞。Westernblot结果显示在LNCaP、VCaP和C4-2B细胞中，TM和thapsigargin(TG，另一种ROS诱导剂)均能促进TXNDC9的表达且该效应具有时间和剂量依赖性。以上结果表明，在前列腺癌细胞中TXNDC9为ROS反应性基因并且可能与AR之间存在相关性。
3.TXNDC9在前列腺癌组织中高表达:为了探讨TXNDC9在前列腺癌组织中的表达特点，我们首先使用前列腺癌GEO数据库分析了TXNDC9与前列腺癌分期和分级之间的相关性，结果显示，与良性增生性前列腺组织相比，TXNDC9mRNA表达水平在CRPC组织中明显上调，并且与肿瘤的病理学分期和Gleason评分呈正相关;其次我们使用免疫组织化学技术分析了TXNDC9在良性前列腺组织、中分化及高分化前列腺癌组织以及CRPC组织中的表达水平，结果显示TXNDC9蛋白表达与Gleason评分呈正相关，其中在CRPC组织中升高最为显著。
4.TXNDC9促进前列腺癌细胞增殖和肿瘤形成:为了探讨TXNDC9在前列腺癌细胞中的生物学功能，我们构建了靶向TXNDC9的siRNA和过表达质粒。细胞增殖和细胞凋亡实验证实，与对照组相比较，TXNDC9低表达抑制LNCaP细胞增殖、促进细胞凋亡;相反，TXNDC9高表达促进细胞增殖、抑制细胞凋亡。本研究还发现TXNDC9能部分拮抗ROS所引起的细胞增殖减弱和凋亡增强。裸鼠皮下成瘤实验进一步证实，稳定过表达TXNDC9可促进肿瘤生长。
5.TXNDC9促进雄激素剥夺条件下前列腺癌细胞的增殖和肿瘤形成:雄激素剥夺治疗(androgen deprivation therapy，ADT)是前列腺癌的经典治疗手段。为探讨TXNDC9在雄激素剥夺前后的表达和作用，我们首先在LNCaP细胞中检测了雄激素剥夺条件下TXNDC9蛋白水平的表达，结果显示随着雄激素剥夺时间延长TXNDC9的表达量呈升高趋势;细胞增殖实验显示，过表达TXNDC9后明显促进了雄激素剥夺条件下LNCaP细胞的增殖。裸鼠皮下成瘤实验进一步证实，过表达TXNDC9后促进了去势条件下裸鼠肿瘤的生长。以上结果显示TXNDC9可促进雄激素剥夺条件下前列腺癌细胞生长和肿瘤形成。
6.TXNDC9促进AR信号通路活化:上述结果提示TXNDC9与AR之间存在相关性。为进一步阐述两者之间的关系，我们在沉默TXNDC9表达后检测了前列腺癌LNCaP细胞AR蛋白的表达变化。结果显示在LNCaP细胞中过表达或沉默TXNDC9后促进或抑制了AR蛋白水平的表达。其次，在LNCaP细胞中干扰TXNDC9表达后，给予雄激素刺激，可明显抑制雄激素诱导的AR入核以及AR靶基因的表达。
7.TXNDC9参与ROS对AR信号通路的活化:文献报道ROS通过多种途径激活AR信号通路，那么TXNDC9作为在前列腺癌中高表达的ROS反应性基因，在ROS激活的AR信号通路中是否发挥作用呢？Westernblot结果显示在LNCaP细胞中沉默TXNDC9表达后，ROS所诱导的AR蛋白水平升高受到抑制。核浆分离和qRT-PCR实验证实，沉默TXNDC9表达后由ROS所致的AR入核和AR靶基因高表达均受到抑制。
综上所述，TXNDC9在前列腺癌组织中表达升高并且扮演癌基因的角色;TXNDC9为ROS反应性基因，参与了ROS促AR信号通路的激活。
第二部分TXNDC9通过促进PRDX1蛋白的稳定性激活AR信号通路并促进前列腺癌的进展
本研究前期工作已证实TXNDC9在前列腺癌组织中高表达并且与肿瘤进展呈正相关，TXNDC9在ROS激活AR信号通路中发挥重要影响。因此，进一步探讨TXNDC9激活AR信号通路的机制，有助于深刻理解ROS对AR信号通路的作用。本部分研究通过GST-pulldown实验联合质谱分析，系统筛选与TXNDC9相互作用的蛋白，并通过体内外实验，从多层面解析了TXNDC9对AR信号通路的作用机制，取得了以下结果:
1.GST-pulldown联合质谱分析筛选出与TXNDC9相互作用的蛋白:采用GST-pulldown联合质谱分析技术，以GST-TXNDC9为诱饵寻找与其结合的蛋白，结果显示与AR信号通路具有密切相关性的过氧化物还原酶1(peroxiredoxin 1，PRDX1)和小鼠双微体基因2(murine double minute2，MDM2)均与TXNDC9存在结合。免疫共沉淀实验证实在LNCaP和VCaP细胞中TXNDC9与PRDX1和MDM2存在内源性结合。
2.ROS条件下PRDX1增加AR蛋白的稳定性:PRDX1是过氧化物酶家族中的一员，在过氧化物的清除中发挥重要作用。有研究指出在ROS和热休克条件下PRDX1以二聚体的形式主要发挥分子伴侣作用，通过与AR结合促进AR蛋白的稳定性，此时其抗氧化作用消失。本研究中，我们首先检测了ROS条件下PRDX1的抗氧化活性，结果显示在基础状态下PRDX1发挥抗氧化作用，但是在TM刺激条件下其抗氧化作用消失。并且Co-IP实验显示:LNCaP、VCaP和C4-2B细胞在ROS刺激条件下PRDX1与TXNDC9结合减弱但是与AR结合增强。Westernblot结果显示，在ROS条件下PRDX1通过增强AR蛋白的稳定性促进AR蛋白及其靶基因的表达。
3.TXNDC9负向调控MDM2蛋白的表达:在质谱结果中我们还鉴别出MDM2与TXNDC9存在结合。Co-IP结果显示，在ROS条件下，LNCaP、VCaP和C4-2B细胞中MDM2与AR结合减少，与TXNDC9结合增加。其次，我们检测了ROS和TXNDC9对MDM2表达的影响，结果显示，ROS和TXNDC9均抑制MDM2蛋白表达;同时ROS对MDM2的抑制作用受到TXNDC9的负向调控。以上结果提示，TXNDC9通过与MDM2结合进而抑制了MDM2与AR结合，促进了MDM2蛋白的降解和AR蛋白的稳定性。
4.PRDX1调控AR与MDM2的结合:为进一步探讨PRDX1、MDM2和TXNDC9之间的相关性，我们在LNCaP、VCaP和C4-2B细胞中分别沉默PRDX1和MDM2表达后，分别以MDM2和PRDX1为诱饵抗体，使用Co-IP分别检测了MDM2/AR和PRDX1/AR之间的结合。结果显示与对照组相比，在ROS条件下，沉默PRDX1表达后MDM2与AR结合增多。但是在沉默MDM2表达后，PRDX1与AR结合没有明显变化，以上结果提示PRDX1影响了MDM2与AR的结合。那么MDM2、PRDX1和AR之间是否存在竞争性结合呢？我们在LNCaP和C4-2B细胞转入不同浓度的Flag-PRDX1质粒后，以AR为诱饵抗体，使用Co-IP检测AR与PRDX1和MDM2的结合。结果显示，随着PRDX1质粒浓度升高，PRDX1与AR结合增多，但与MDM2结合减少。以上结果表明，PRDX1与MDM2竞争性结合AR。
5.PRDX1抑制剂抑制前列腺癌细胞增殖和肿瘤形成:依据以上结果，我们假设TXNDC9以PRDX1依赖性的形式促进前列腺癌进展，PRDX1可能是新颖的治疗靶标。因此，我们使用PRDX1抑制剂ConoidinA(CoA)进行了进一步的体内外实验。qRT-PCR结果显示，在LNCaP细胞中，CoA明显抑制了TXNDC9所引起的AR靶基因(PSA和KLK2)表达。裸鼠皮下成瘤实验结果显示，与对照组相比较，CoA明显抑制TXNDC9高表达组裸鼠肿瘤体积的增长。更为重要的是，在CRPC细胞模型C4-2B细胞中，与单独加入Enz或CoA比较，两者联合用药后抑制肿瘤细胞增殖的效率更为显著。上述结果提示AR信号通路抑制剂和PRDX1抑制剂的联合使用可能延缓前列腺癌的进展，尤其对TXNDC9高表达的前列腺癌更为明显。
综上所述，TXNDC9是ROS激活AR信号通路的重要调节分子。在ROS条件下，TXNDC9表达水平升高，一方面TXNDC9与PRDX1解离，促进PRDX1与AR结合，增强AR蛋白的稳定性;另一方面TXNDC9与MDM2的结合，促进了MDM2蛋白的降解，抑制了MDM2与AR的结合。两者协同促进AR信号通路活化。上述研究丰富了ROS激活AR信号通路的作用机制，为前列腺癌的干预治疗提供了新的靶点。