microRNAs(简称miRNA)是一类内源的长约20～24碱基的RNA分子，它们通过mRNA降解和翻译抑制等方式，特异地对靶基因进行转录后调控。叶发育是叶原基细胞有序的分裂，生长和分化的过程。研究表明miRNA通过靶基因的抑制作用，影响其表达水平和空间分布，参与叶发育过程的基因调控。　　 拟南芥miR393由2个基因座MIR393a和MIR393b编码，其靶基因是生长素受体TIR1(TRANSPORT INHIBITOR RESPONSE PROTEIN1)和三个F-box家族成员AFB1(AUXIN SIGNALING F BOX PROTEIN1)、AFB2和AFB3。本研究开展了拟南芥叶发育中MIR393基因表达模式的研究，并通过对miR393功能突变的转基因植株叶表型的观察，以期阐明miR393在叶发育中的功能。获得的主要结果如下：　　 1.叶发育过程MIR393基因家族表达模式研究　　 对启动子报告株系pMIR393a：GUS和pMIR393b：GUS的幼苗进行GUS组织化学染色，结果表明两者表达位置基本相同，但MIR393b启动子活性高于MIR393a。MIR393a和b主要在子叶叶脉，茎尖分生组织和下胚轴表达，在莲座叶的叶脉和气孔中也检测到较强的GUS信号。在幼嫩新生叶的最远端叶脉汇集处观察到GUS信号的局部高表达，但叶生长1周后，局部强信号逐渐消失。　　 利用定量RT-PCR检测叶发育过程中miR393，MIR393前体和靶基因表达的动态变化，结果表明在老叶(第一、二对真叶)中miR393的水平显著高于新生叶(第三、四对真叶)，且与前体表达水平的变化一致，暗示MIR393转录水平的变化可能是叶发育过程miR393积累水平变化的主要因素。同一片叶子的近端和远端区域miR393水平无显著差异。miR393水平与靶基因TIR1和AFB3的转录本水平无明显的负相关性。　　 2.用于miR393功能研究的转基因材料的构建　　 通过定点突变TIR1基因中miR393结合位点，构建了pTIR1：mTIR1载体，转化野生型Co和tir1-1拟南芥，获得了转基因纯合株系。利用模拟靶基因抑制miRNA作用的策略，构建了35S：MIM393，获得了转基因纯系。靶基因半定量RT-PCR检测结果显示，转基因植株中TIR1和AFB3的转录本水平上调。为研究MIR393a和MIR393b功能的差异性，获得特异性抑制MIR393a或MIR393b功能的突变体材料，构建了35S：anti393a和35S：anti393b载体，获得了转基因纯合株系。经筛选获得纯合的T-DNA插入的mir393a突变体(SALK104430)，经定量RT-PCR检测，MIR393a前体水平下降。为精确观察miR393积累位点及其与靶基因时空表达模式的相关性，构建了35S：393 Sensor和35S：393 muSensor载体，以期利用差异GFP信号的位点指示miRNA表达的位点。这些材料的获得将为进一步研究miR393的功能，及MIR393a和MIR393b功能的差异性奠定基础。　　 3.拟南芥miR393在叶发育中的功能研究　　 对miR393功能抑制的各转基因植株进行了叶表型的观察，结果显示，与野生型相比，35S：cTIR1，35S：mTIR1和pTIR1：mTIR1植株的叶表型发生了明显变化，植株呈现叶边缘下卷和叶柄上翘的现象，其35S：mTIR1和pTIR1：mTIR1叶卷曲和上翘程度较强，35S：TIR1次之，35S：MIM393的表型则更温和。　　 对土壤培养28天的拟南芥进行叶表型的数据统计，包括莲座叶数目(Rosetteleaves)、叶长宽比(length/width)和叶片的偏上性(Leaf epinasty)。结果表明莲座叶数目与TIR1基因表达水平有相关性，在突变体tir1-1中莲座叶显著变少，而35S：cTIR1和35S：mTIR1以及pTIR1：mTIR1显著变多。此外，35S：mTIR1及pTIR1：mTIR1植株叶偏上性值有显著升高。　　 此外，还检测了不同转基因突变体中生长素相关基因和叶发育相关基因的表达情况，发现生长素早期响应因子GH3.3与TIR1的表达量呈明显的正相关性，说明miR393介导的对TIR1的调控是通过植物生长素信号通路在拟南芥叶的生长和发育中起重要功能。