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第一部分苦参碱对外膜蛋白A过表达大肠杆菌生物膜形成影响的研究目的:构建外膜蛋白A(Omp A)过表达大肠杆菌生物膜模型,探讨不同浓度苦参碱对外膜蛋白A过表达大肠杆菌形成生物膜能力的影响。方法:构建Omp A过表达的大肠杆菌生物膜模型,采用二倍稀释法测量苦参碱对Omp A过表达的大肠杆菌的最低有效抑菌浓度(MIC)。使用腹膜透析外接短管为载体,构建大肠杆菌生物膜(Biofilm,BF)模型,将载体放入6孔板中并随机分为3组:空白对照组(阴性对照组)、1/2MIC苦参碱组、1/4MIC苦参碱组。于大肠杆菌生物膜形成的早期中期和晚期(对应1天、3天和7天)。通过快速银染观察各组生物膜形成情况,使用结晶紫半定量法对各组大肠杆菌生物膜进行相对定量。结果:苦参碱对Omp A过表达的大肠杆菌的MIC为4096μg/ml。快速银染检测显示,空白组及1/4MIC苦参碱组,在生物膜形成的早、中和晚期三个时间段,经银染后载体表面均可见大片的黑褐色团块状生物膜的形成,而1/2MIC苦参碱组的载体表面黑褐色团块状物质呈散在状,数量较少。生物膜形成的结晶紫半定量检测,在第3天和第7天,1/2MIC苦参碱组以及1/4MIC苦参碱组半定量结果均低于空白对照组。结论:Omp A过表达的大肠杆菌菌株能够形成生物膜。苦参碱能够抑制Omp A过表达的大肠杆菌生物膜的形成。第二部分苦参碱对外膜蛋白A过表达的大肠杆菌生物膜形成的影响:对Omp A、Mic A以及σE的作用目的:探讨在外膜蛋白A过表达的大肠杆菌生物膜形成的早、中、晚期,不同浓度的苦参碱对大肠杆菌Omp A、Mic A以及σE表达量的影响。方法:以Omp A过表达的大肠杆菌为研究对象,在6孔板内以腹膜透析外接短管为载体,构建大肠杆菌体外生物膜(Biofilm,BF)模型。实验分为3组:空白对照组(阴性对照组)、1/2MIC苦参碱组、1/4MIC苦参碱组。在构建生物膜模型的0小时加入苦参碱干预,取干预后1天、3天和7天(分别对应大肠杆菌生物膜形成的早期、中期和晚期)的载体进行实验。使用蛋白质印迹法(Western blot)以及实时荧光定量PCR检测载体上生物膜内大肠杆菌Omp A、Omp A m RNA、Mic A以及σE的表达量。结果:在大肠杆菌生物膜形成的中(3天)、晚(7天)期,相较于空白对照组,1/2MIC苦参碱组、1/4MIC苦参碱组,在蛋白水平上外膜蛋白A的表达量均有所减少(P<0.05)。在大肠杆菌生物膜形成的早(1天)、中(3天)和晚(7天)期,与空白对照组相比,1/2MIC苦参碱组、1/4MIC苦参碱组,Omp A的表达量在m RNA转录水平上均有所减少(P<0.05)。同时,在大肠杆菌生物膜形成的中期和晚期,Mic A以及σE的表达量均有所上调(P<0.05)。结论:苦参碱能够抑制Omp A过表达的大肠杆菌生物膜中期和晚期的Omp A在蛋白质水平和m RNA水平的表达,同时上调生物膜形成中晚期的Mic A和σE的表达。验证了苦参碱是通过抑制Omp A的表达进而抑制大肠杆菌生物膜的形成。