水稻(Oryza sativa L.)不仅是世界上主要的粮食作物之一；而且是单子叶作物研究的重要模式植物(基因组小以及全基因组测序完成)。氮素(N)是农作物产量的重要限制因子,铵态氮(NH4+)和硝态氮(NO3-)是植物从土壤中吸收的主要矿质氮源。尽管在淹水条件下土壤中氮素主要以铵态氮形式存在,但是有研究表明水稻根系能够泌氧,从而在硝化细菌作用下将根际土壤中铵态氮转化为硝态氮；还有在水稻生长发育的后期由于干湿交替的灌溉方式使得土壤中存在大量的硝态氮,在潮湿土壤状况下水稻根系吸收硝态氮占总氮量的40%。然而关于水稻是如何吸收硝态氮的生理与分子机制方面报道还很少。在拟南芥、大麦上发现高亲和硝态氮运输是通过双组分系统(NAR2s. NRT2s)来实现的,其运输蛋白以及辅助蛋白基因的功能已经被鉴定。本论文主要从以下几个方面入手：半定量RT-PCR分析OsNAR2s和OsNRT2s表达模式；蛙卵异源表达研究水稻双组份硝态氮运输系统；利用RNAi技术获得OsNAR2.1突变体；半定量RT-PCR、定量RT-PCR和Western杂交分析突变体OsNAR2.1沉默效果；15N分别标记NH4+和NO3-分析osnar2.1突变体对氮素吸收；电生理测定osnar2.1突变体根系细胞对NO3-响应；不同氮素形态培养下osnar2.1突变体根系形态和产量分析；基因芯片分析可能受OsNAR2.1直接或间接调控的基因,从而了解水稻硝态氮运输辅助蛋白基因是如何影响水稻对硝态氮吸收以及在其它方面可能作用的生理与分子机制。主要研究结果如下：1)利用半定量RT-PCR分析了OsNAR2s和OsNRT2s的表达模式。发现OsNAR2.1、OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNRT2.3a以及OsNRT2.4表达都受硝态氮诱导,但是都受铵态氮和天冬氨酸强烈抑制,而OsNAR2.2和OsNRT2.3b表达不受氮形态以及四个氨基酸影响(Glu、Gln、Asp、Asn), OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNRT2.3a以及OsNRT2.4表达还受谷氨酰胺和天冬酰胺抑制,而OsNAR2.1表达不受影响；所有OsNAR2s和OsNRT2s家族基因表达不受硝态氮浓度的影响；另外在这些基因当中,除了OsNRT2.3b和OsNRT2.4在叶片中表达,而且OsNRT2.4在叶片表达比在根系中强,其余基因都在根系中表达。2)蛙卵异源表达研究水稻硝态氮运输双组份系统。结果表明OsNAR2.1不仅能够促进OsNRT2.1/OsNRT2.2(两个基因的蛋白一样)对硝态氮的吸收,而且还能够促进OsNRT2.3a对硝态氮的吸收,但是比OsNRT2.3a少30个氨基酸的OsNRT2.3b却能够独立地吸收硝态氮,而不需要OsNAR2.1的帮助。OsNAR2.1的同源蛋白OsNAR2.2不能代替其行使相互作用的功能。进一步研究发现OsNRT2.1/OsNRT2.2和OsNAR2.1对硝态氮的亲和力Km值为0.034 mM; OsNRT2.3a和OsNAR2.1对硝态氮的亲和力Km值为0.31 mM,前者的Km值是后者的将近1/10。因此,在低外界硝态氮浓度下前者起主要作用,而在高外界硝态氮浓度下后者起主要作用。3)利用RNAi干扰技术获得OsNAR2.1沉默效果较好的两个突变体株系。定量RT-PCR分析它们的沉默效率分别为84.6%(r1)、79.1%(r2)。进一步通过OsNAR2.1蛋白特异性抗体进行Western杂交分析发现osnar2.1突变体两个株系蛋白表达量也显著下降了。同时还发现OSNAR2.1沉默以后还抑制硝态氮运输蛋白基因OsNRT2.1、OsNRT2.2和OsNRT2.3α表达,而OsNAR2.2、OsNRT2.3b、OsNRT2.4和OsNRT1.1的表达没有受到影响。因此,OSNAR2.1可能直接或间接调控OsNRT2.1、OsNRT2.2和OSNRT2.3a表达。4)利用15N分别标记NH4+和NO3-分析osnar2.1突变体对氮素吸收。结果发现OsNAR2.1沉默后,水稻对铵态氮吸收没有受到影响,但是不仅低浓度硝态氮吸收显著减少,而且高浓度硝态氮吸收也显著减少。进一步研究发现在0.2 mM NO3-条件下两个突变体株系对硝态氮吸收速率比野生型植株分别下降了84-86%,即使在5 mMN03-条件下它们对硝态氮吸收速率比野生型植株也分别下降了69-73%。离子选择性微电极研究突变体对硝态氮响应,结果发现突变体根系细胞不再响应低浓度硝态氮,而对高浓度硝态氮响应也小于野生型根系细胞。所有这些都证实了osnar2.1突变体植株对高和低浓度的硝态氮吸收都受到破坏。5)研究不同氮浓度以及氮形态(0.2mM NO3-、5mM NO3和0.2 mM NH4+)培养下osnar2.1突变体苗期生长情况。结果表明在0.2 mMNH4+条件下两个突变体株系和野生型植株生长没有显著差异,而在0.2 mM N03-培养下,两个突变体株系长的明显小于野生型植株,而且它们的叶片发黄、出现缺氮症状。两个突变体株系地上部和根系的生物量、总氮浓度也都显著低于野生型植株,即使在5 mM NO3-培养下,两个突变体株系和野生型植株在地上部和根系的生物量以及总氮浓度这些方面也都存在显著差异。抽穗期后氮素处理实验也证实了这一点,还发现在0.2 mM NO3-和5 mM N03-培养下两个突变体株系的结实率和产量都要远低于野生型植株。6)研究了OsNAR2.1沉默对水稻根系形态的影响。发现在含有0.2 mMNO3-垂直琼脂平板培养下两个突变体株系的主根和野生型植株没有显著差异,但是它们的侧根长度显著短于野生型植株。而在0.2 mM NH4+条件下它们的根系形态没有显著差异,进一步研究发现与拟南芥影响侧根发育信号途径关键基因ANR1水稻同源的基因OsMADS在osnar2.1突变体中表达受到抑制,而且受硝态氮诱导表达。因此推测OsNAR2.1对水稻根系形态的影响可能是通过抑制OsMADS的表达进而影响水稻侧根的生长。7)利用基因芯片技术分析在0.2 mMNO3-培养下osnar2.1突变体全基因组表达。结果再次表明OSNAR2.1沉默影响水稻对硝态氮吸收和利用,还有一个新的发现是突变体中氧气的运输受到抑制。进一步研究分析与拟南芥控制通气组织形成途径中关键基因的水稻同源基因表达情况发现OsPAD4在osnar2.1突变体中表达受到抑制,而且受硝态氮的诱导。综述所述,水稻硝态氮运输辅助蛋白基因OsNAR2.1不仅能够促进OsNRT2.1/OsNRT2.2和OsNRT2.3a对硝态氮的吸收,而且还可能直接或者间接调控这三个基因的表达；OsNAR2.1沉默后不仅影响了水稻对低浓度的硝态氮吸收,而且还影响了水稻对高浓度的硝态氮吸收；OsNAR2.1还通过抑制OsMADS的表达进而影响水稻侧根的生长。