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肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的原发性肝癌，也是全世界最常见的恶性肿瘤之一。该病的致死率在所有癌症中位居第三。临床上具有早期起病隐匿、复发率高、往往预后不良的特点。随着对HCC的研究不断深入，在HCC的发生和发展方面已有重大进展，但HCC病变的分子生物学机制仍旧尚未明确。近几年HCC的五年生存率也未得到显著提高。HCC作为一个全球性的健康问题，给医学界带来了极大的挑战。癌细胞迁移大大促进了HCC的恶性进展，因此从分子水平研究HCC细胞的迁移来帮助理解HCC病理机制显得尤为重要，从相关分子机制入手还有助于临床开发出有效的HCC诊疗方法。
microRNA（miRNA）是一类长度约在22个核苷酸左右的小分子单链RNA，它是由具有内源性发夹结构的初始miRNA经多种核酸内切酶剪切而形成的。功能上，它遵照碱基互补配对的原则识别相应的靶mRNA的3’-UTR（3’-端非编码区）序列，并与之结合，抑制翻译过程或促使mRNA发生降解，从而在转录或转录后水平调控基因的表达，发挥稳态作用。研究表明，miRNA可以通过靶向不同的靶基因和介导相关信号通路参与到肝细胞发育、肿瘤的增殖分化、迁移和凋亡等多种途径，异常表达的miRNA与HCC的进展十分密切。miR-4429是一种被发现在多种癌症中起抑癌作用的miRNA，已有研究指出可以通过对血清中AFP、miR-4487和miR-21进行联合检测来提高HCC诊断的灵敏度和特异度；而目前关于miR-4487和癌症关系的研究寥寥可数，但有研究指出miR-4487在HCC患者血清中表达水平比全血中高，提示其可能参与HCC的发生。因此，本文将对miR-4429和miR-4487在HCC细胞迁移中的影响和潜在分子机制做进一步探讨和研究。
目的：
本研究第一部分以人HCC细胞株HepG2、Huh7为研究对象，首先评估miR-4429和miR-4487在HCC细胞中的表达水平；然后进行转染实验得到过表达miR-4429和过表达miR-4487的细胞，接下来通过划痕实验行为学实验分别检测过表达miR-4429和过表达miR-4487对HCC细胞迁移能力的影响。第二部分使用microRNA靶基因在线预测软件预测miR-4429和miR-4487的潜在靶标，并使用RT-qPCR对预测靶基因进行验证，随后进一步探讨miR-4429、miR-4487影响HCC迁移的潜在机制。
方法：
第一部分：
1.体外培养肝癌细胞系HepG2和Huh7细胞，提取细胞总miRNA，以U6作为内参，用RT-qPCR实验检测HCC细胞中miR-4429和miR-4487的相对表达量；
2.运用脂质体转染技术将miR-4429mimic、miR-4487mimic瞬时转染进HepG2和Huh7细胞系中，24h后收集细胞，RT-qPCR实验检测转染效率；
3.采用划痕实验检测HepG2和Huh7细胞分别过表达miR-4429、miR-4487后的迁移能力；
第二部分：
使用Target Scan、miRDB、TargetMiner、Diana Tool生物信息分析软件预测miR-4429、miR-4487的潜在靶基因。以HepG2细胞为实验对象，运用RT-qPCR对其中部分预测基因进行初步验证。结合文献和资料，进一步分析miR-4429、miR-4487在HCC细胞迁移过程中可能作用的靶基因及其分子机制。
结果：
第一部分：
1.RT-qPCR检测miR-4429、miR-4487的相对表达量结果显示，Huh7细胞中miR-4429和miR-4487的表达量都约为U6水平的1%（***，P＜0.005）,HepG2细胞中所研究的两个miRNA的表达量也不到U6水平的10%（***，P＜0.005）；
2.RT-qPCR检测miRNA转染效率结果显示，将miR-4429mimic、miR-4487mimic分别转染入HepG2和Huh7细胞后，mimic组miR-4429、miR-4487的表达水平显高于对照组。
3.划痕实验结果显示，在HepG2和Huh7细胞中，对照组中（NC组），24h和48h组的划痕距离明显窄于0h，表明细胞的迁移能力较强；而两组转染组（miR-4429、miR-4487mimic组）中，24h和48h组的划痕距离较0h而言变化不明显。
第二部分：
1.使用四个生物信息学分析软件分别预测miR-4429和miR-4487的作用靶标，随后运用Venny2.1.0软件取各预测软件结果的交集，得到miR-4429有21个潜在靶标，miR-4487有13个潜在靶标，其中选取miR-4429的预测靶基因KITLG、ARFIP和miR-4487的预测靶基因HIPK2、ESR1、CDKN1A进行下一步验证；
2.RT-qPCR验证靶基因结果显示，KITLG、ARFIP在HepG2细胞转染miR-4429前后的表达差异没有统计学意义；HIPK2、ESR1、CDKN1A在细胞转染miR-4487前后的表达水平也没有显著性差异。
讨论：
第一部分：
1.miR-4429和miR-4487在HepG2和Huh7细胞中均呈现出相对较低的表达水平；
2.过表达miR-4429和过表达miR-4487的情况均能抑制HCC细胞的迁移能力。且转染结果表明，miR-4429mimic和miR-4487mimic分别能明显提高miR-4429和miR-4487的表达水平，提示转染实验成功将miR-4429mimic和miR-4487mimic瞬时转染进入细胞，有助于下一部分实验的进行。
第二部分：
不同的在线生物信息软件分别预测到多个相同的基因，但RT-qPCR结果不支持KITLG、ARFIP为miR-4429靶基因的假设，也不支持HIPK2、ESR1、CDKN1A为miR-4487靶基因的假设。通过进一步分析，发现miR-4429可能通过作用于β-catenin诱导GREB1参与HCC的迁移和进展；miR-4487可能靶向ULK1参与HCC细胞迁移的调控。
microRNA（miRNA）是一类长度约在22个核苷酸左右的小分子单链RNA，它是由具有内源性发夹结构的初始miRNA经多种核酸内切酶剪切而形成的。功能上，它遵照碱基互补配对的原则识别相应的靶mRNA的3’-UTR（3’-端非编码区）序列，并与之结合，抑制翻译过程或促使mRNA发生降解，从而在转录或转录后水平调控基因的表达，发挥稳态作用。研究表明，miRNA可以通过靶向不同的靶基因和介导相关信号通路参与到肝细胞发育、肿瘤的增殖分化、迁移和凋亡等多种途径，异常表达的miRNA与HCC的进展十分密切。miR-4429是一种被发现在多种癌症中起抑癌作用的miRNA，已有研究指出可以通过对血清中AFP、miR-4487和miR-21进行联合检测来提高HCC诊断的灵敏度和特异度；而目前关于miR-4487和癌症关系的研究寥寥可数，但有研究指出miR-4487在HCC患者血清中表达水平比全血中高，提示其可能参与HCC的发生。因此，本文将对miR-4429和miR-4487在HCC细胞迁移中的影响和潜在分子机制做进一步探讨和研究。
目的：
本研究第一部分以人HCC细胞株HepG2、Huh7为研究对象，首先评估miR-4429和miR-4487在HCC细胞中的表达水平；然后进行转染实验得到过表达miR-4429和过表达miR-4487的细胞，接下来通过划痕实验行为学实验分别检测过表达miR-4429和过表达miR-4487对HCC细胞迁移能力的影响。第二部分使用microRNA靶基因在线预测软件预测miR-4429和miR-4487的潜在靶标，并使用RT-qPCR对预测靶基因进行验证，随后进一步探讨miR-4429、miR-4487影响HCC迁移的潜在机制。
方法：
第一部分：
1.体外培养肝癌细胞系HepG2和Huh7细胞，提取细胞总miRNA，以U6作为内参，用RT-qPCR实验检测HCC细胞中miR-4429和miR-4487的相对表达量；
2.运用脂质体转染技术将miR-4429mimic、miR-4487mimic瞬时转染进HepG2和Huh7细胞系中，24h后收集细胞，RT-qPCR实验检测转染效率；
3.采用划痕实验检测HepG2和Huh7细胞分别过表达miR-4429、miR-4487后的迁移能力；
第二部分：
使用Target Scan、miRDB、TargetMiner、Diana Tool生物信息分析软件预测miR-4429、miR-4487的潜在靶基因。以HepG2细胞为实验对象，运用RT-qPCR对其中部分预测基因进行初步验证。结合文献和资料，进一步分析miR-4429、miR-4487在HCC细胞迁移过程中可能作用的靶基因及其分子机制。
结果：
第一部分：
1.RT-qPCR检测miR-4429、miR-4487的相对表达量结果显示，Huh7细胞中miR-4429和miR-4487的表达量都约为U6水平的1%（***，P＜0.005）,HepG2细胞中所研究的两个miRNA的表达量也不到U6水平的10%（***，P＜0.005）；
2.RT-qPCR检测miRNA转染效率结果显示，将miR-4429mimic、miR-4487mimic分别转染入HepG2和Huh7细胞后，mimic组miR-4429、miR-4487的表达水平显高于对照组。
3.划痕实验结果显示，在HepG2和Huh7细胞中，对照组中（NC组），24h和48h组的划痕距离明显窄于0h，表明细胞的迁移能力较强；而两组转染组（miR-4429、miR-4487mimic组）中，24h和48h组的划痕距离较0h而言变化不明显。
第二部分：
1.使用四个生物信息学分析软件分别预测miR-4429和miR-4487的作用靶标，随后运用Venny2.1.0软件取各预测软件结果的交集，得到miR-4429有21个潜在靶标，miR-4487有13个潜在靶标，其中选取miR-4429的预测靶基因KITLG、ARFIP和miR-4487的预测靶基因HIPK2、ESR1、CDKN1A进行下一步验证；
2.RT-qPCR验证靶基因结果显示，KITLG、ARFIP在HepG2细胞转染miR-4429前后的表达差异没有统计学意义；HIPK2、ESR1、CDKN1A在细胞转染miR-4487前后的表达水平也没有显著性差异。
讨论：
第一部分：
1.miR-4429和miR-4487在HepG2和Huh7细胞中均呈现出相对较低的表达水平；
2.过表达miR-4429和过表达miR-4487的情况均能抑制HCC细胞的迁移能力。且转染结果表明，miR-4429mimic和miR-4487mimic分别能明显提高miR-4429和miR-4487的表达水平，提示转染实验成功将miR-4429mimic和miR-4487mimic瞬时转染进入细胞，有助于下一部分实验的进行。
第二部分：
不同的在线生物信息软件分别预测到多个相同的基因，但RT-qPCR结果不支持KITLG、ARFIP为miR-4429靶基因的假设，也不支持HIPK2、ESR1、CDKN1A为miR-4487靶基因的假设。通过进一步分析，发现miR-4429可能通过作用于β-catenin诱导GREB1参与HCC的迁移和进展；miR-4487可能靶向ULK1参与HCC细胞迁移的调控。