第一部分BCR-ABL1阳性微泡的生物学特征及内容物分析目的：微泡(MV)是一种新型的细胞间信息交流载体,具有丰富的生物学功能；MV的生物学功能由其携带的内容物决定,不同应激条件下MV的内容物存在较大差异,是细胞的一种适应性机制。本部分研究拟以K562细胞为代表,了解慢性髓性白血病(CML)来源MV的生物学特性以及主要包含的内容物,明确其功能指向；同时探讨应激状态下K562细胞及其MV中miRNA表达谱等内容物的改变。方法：体外培养K562细胞,采用梯度离心法收集MV；离心获得的沉淀物以透射电镜观察,流式细胞仪分析其大小和表面标志,同时采用PKH-26及CFSE等荧光染料染色沉淀物后于激光共聚焦和荧光显微镜下观察；经鉴定是MV后提取其中的RNA,实时定量PCR检测其中的BCR-ABL1表达,荧光原位杂交(FISH)检测其中的染色体片段；在此基础上,采用低血清培养刺激K562细胞并收集其来源的MV,以正常培养的K562细胞及其MV作为对照,芯片检测四个样本中的miRNA表达谱；对比分析不同状态下MV中miRNA表达谱的差异,生物信息学分析差异niRNA分子可能参与的生物学行为。最后,构建自主创新的小鼠骨质移植微小残留病(MRD)模型,实时定量PCR方法定期检测小鼠外周血细胞及MV中BCR-ABL1水平。结果：我们采用梯度离心方法获取的沉淀物,经透射电镜、荧光显微镜、共聚焦显微镜观察发现为一种直径0.1-1.0μm的游离于细胞外的双层脂质小囊泡结构,携带有母体细胞的细胞器和部分细胞质,符合国内外文献对MV的定义。流式细胞仪检测发现,K562-MV大小均小于1.0μm,主要分布区间为0.3μm,0.5μm和0.8μm,表面表达大量的Annexin V分子。实时定量PCR证明K562-MV中可检出BCR-ABL1mRNA,FISH结果发现MV中携带Ph染色体片段。利用K562细胞成功构建同种骨质移植小鼠MRD模型,肿瘤细胞在同种移植骨质中能够存活约10周；定期检测外周血细胞及MV中BCR-ABL1发现,基于细胞检测持续阴性时,MV中BCR-ABL1水平却逐渐升高,提示MV极有可能优先于细胞进入外周血。miRNA表达谱分析发现,饥饿应激后K562细胞中miR-1826、miR-1、miR-197、miR-92b等分子水平下降,其作用靶点主要为VEGF、Wnt等通路,可能与维持自身存活信号相关；饥饿后的K562-MV中这部分miRNA分子表达水平升高,推测K562细胞接受饥饿刺激后可能通过MV外排大量miRNA降低自身表达水平,是细胞应对环境改变的适应性新机制。此外,K562-MV中高表达的部分miRNA (如miR-125b)具有显著的促癌效应,提示这部分MV可能具有恶性转化其他正常细胞的功能。结论：我们在这部分研究中成功分离并鉴定了K562-MV并初步阐明了其中的内容物组成；应激条件下,MV可能是细胞通过非降解途径外排多种物质(尤其是niRNA分子)的关键介质；K562-MV中负载大量致癌性miRNA及BCR-ABL1mRNA,可能具有恶性转化正常细胞的功能；此外,MV可能还是一种先于细胞出现在外周血循环的优秀检测指标。第一部分BCR-ABL1阳性微泡恶性转化正常造血细胞目的：既往研究表明,采用分子生物学手段在正常造血干/祖细胞(HSPC)中表达BCR-ABL1能够单基因驱动慢性髓性白血病(CML)样改变,联合额外的促癌因素则能够诱导HSPC转化为急性白血病细胞；我们前一部分的研究发现K562-MV中包含癌性酪氨酸激酶BCR-ABL1mRNA以及大量促癌性miRNA分子,结合MV是一种在细胞间水平传递物质的新型交流方式,本部分的研究目的是探讨K562-MV是否能够通过传递BCR-ABL1及rniRNA分子恶性转化HSPC。方法：按照前述方法分离、提取及鉴定K562、KG1a、Jurkat等多种肿瘤细胞系来源的MV；临床收集造血干细胞移植供者的外周血动员物、健康志愿者骨髓以及新生儿脐血,Ficoll分离、收集并培养单个核细胞(含HSPC)；以正常人外周血单个核细胞作为对照,采用不同肿瘤细胞来源的MV干预含HSPC的单个核细胞；收集恶性转化的细胞,体外利用形态学、免疫学、细胞遗传学以及分子学分析其是否符合白血病特点,并将这部分细胞注入3-4周龄裸鼠进行体内成瘤实验；共聚焦显微镜观察染色后的K562-MV与靶细胞的相互作用过程,实时定量PCR检测与K562-MV作用前后,靶细胞是否表达BCR-ABL1mRNA及蛋白；对诱导过程中不同时间点的细胞进行表达谱和miRNA谱测序,并进行生物信息学分析；2%琼脂糖电泳检测不同时间点靶细胞中DNA断裂情况,ABI PCR方法检测靶细胞接受恶性转化前后的微卫星不稳定性情况；实时定量PCR和western blot检测诱导过程中不同时间点细胞内RAD51b、 RAD18、DNMT3A、DNMT3B、AICDA等分子的表达水平；全细胞甲基化试剂盒检测诱导过程中不同时点细胞的甲基化DNA占总基因组DNA的比例,甲基特异性PCR检测P53、RIZ-1等抑癌基因启动子区域甲基化水平；ROS试剂盒检测诱导过程中不同时间点靶细胞内ROS水平的改变；在此基础上,在K562中转染miR-203mimics以及采用RNA酶消化K562-MV,实时定量PCR检测转染/消化后K562-MV中BCR-ABL1及miR-203的水平；采用这部分降低了BCR-BAL1mRNA水平的K562-MV重复上述恶性转化实验。结果：我们的结果发现,仅K562-MV能够恶性转化含HSPC的单个核细胞成瘤；新生的肿瘤细胞(以下简称转化细胞)形态类似急性单核细胞白血病细胞,表达CD15、CD38等多种髓系标志,并存在大量的染色体核型异常；转化细胞能够在裸鼠体内成瘤,并能传代二次成瘤,二次成瘤的小鼠出现恶液质样改变,作为对照的K562细胞无法成瘤；机制探讨方面,我们通过共聚焦显微镜发现K562-MV能够与靶细胞融合,并将BCR-ABL1mRNA传递至靶细胞内；对诱导过程中不同时点的靶细胞进行测序发现,具有显著性差异表达的基因主要参与基因组不稳定性的发生；在此基础上,我们采用实验证明靶细胞中存在基因组不稳定：琼脂糖凝胶电泳发现诱导过程中靶细胞内出现大量DNA断裂,同时同源重组酶RAD51b、RAD]8等高度活化,提示诱导过程中DNA断裂和重组同时发生；而诱导前后细胞内微卫星位点的突变不明显；我们进一步通过检测细胞中甲基化改变、活化诱导胞苷脱氨酶(AICDA)水平以及活性氧簇(ROS)阐述了K562-MV诱导靶细胞基因组不稳定性的机制。最后,我们采用miRNA转染以及RNase消化等手段降低K562-MV中的BCR-ABL1mRNA水平后,再以这部分MV恶性转化靶细胞；结果提示BCR-ABL1降低的MV无法诱导HSPC成瘤,其机制是处理后的K562-MV不能传递BCR-ABL1mRNA至靶细胞并诱导其基因组不稳定性,因而无法诱导正常细胞成瘤。结论：本部分研究证明K562-MV能够恶性转化正常造血干/祖细胞,其主要机制是通过MV传递BCR-ABL1等RNA分子至靶细胞中,诱发后者出现基因组不稳定性。这一现象对CML疾病进展以及异基因造血干细胞移植后供者细胞白血病的发生具有重要的提示意义,同时还提供了一种体外研究白血病发生的优秀模型选择。第三部分BCR-ABL1阳性微泡的临床检测意义目的：循环肿瘤微泡(MV)携带有肿瘤细胞的生物信息,是一种良好的疾病监测生物标记物。多个研究发现肿瘤细胞本身匿藏于不易检测的局部时,其分泌的MV能够在外周血中被检出并提供诊断和监测依据。这种现象与白血病经治疗后,残留细胞匿藏于不可检测的骨髓局部极为相似；同时我们的动物研究也证实MV能够提前于细胞进入外周血循环。因此,本部分的研究目标是探讨BCR-ABL1阳性的MV能否有效应用于CML和Ph染色体阳性急性淋巴细胞白血病(Ph+ALL)的微小残留病(MRD)监测及疾病进展的早期预警。方法：遵循自主知情同意原则,本研究共纳入了127例Ph染色体和/或BCR-ABL1阳性的CML患者,包含68名男性与59名女性患者,中位年龄为35岁(10-54岁),服用伊马替尼的中位时间为33个月(3-82个月)。127例患者中,达到完全分子学缓解(CMR)的有36例,37例获得主要分子学缓解(MMR),9例获完全细胞遗传学缓解(CCyR),9例达到血液学缓解(HR),24例患者选择异基因造血干细胞移植。同时,我们的研究还包含15例异基因造血干细胞移植后的Ph+ALL患者,中位年龄为25岁(19-49岁),移植后中位观察时间为12个月(4-21个月)。每名患者按计划每次抽取6m1外周血,梯度离心法分离MV,分离所得的沉淀物经电镜和流式细胞仪验证是否为MV。实时定量PCR(RQ-PCR)检测MV及细胞中的BCR-ABL1mRNA水平,并结合患者疾病进展情况进行统计分析。结果：患者外周血标本梯度离心获得的沉淀物经电镜和流式细胞仪鉴定为MV。这部分MV中能够稳定检出BCR-ABL1mRNA.与细胞中一致,MV中的BCR-ABL1水平随患者的治疗反应不同而改变(HR:106.50±38.3, CCyR:42.20±14.1, MMR:21.05±17.8, CMR:14.08±10.9, P<0.05)。进一步分析发现,在大部分区间范围内MV中的BCR-ABL1水平与细胞中呈现正相关(F0.416,P<0.05)。在疾病不同阶段(CP、AP及BP),患者外周血MV中的BCR-ABL1拷贝数逐渐升高(CP:577.2±11.3, AP:1109.7±131.4,BP：2783.1+462.3,P<0.05)。CMR组患者外周血细胞内BCR-ABL1基因检测均为阴性,但29/37例患者MV内仍可检测出BCR-ABL1拷贝数(14.08±10.9)。在细胞中均为0的情况下,接受TKI治疗的患者MV中BCR-ABL1水平高于接受HSCT组(14.08±10.9vs7.3±-2.1,P<0.05)。15例Ph+ALL中,6例患者在观察过程中复发,其中2例为髓外复发。在获取明确的证据(细胞学和／或分子学)证明患者复发前,均可观察到患者外周血MV中的BCR-ABL1水平升高；而MV中BCR-ABL1水平升高同时无明确证据证明细胞学复发时,应警惕髓外复发的可能。结论：CML患者及Ph+ALL患者外周血MV中均可稳定检出BCR-ABL1mRNA。CML中,CMR患者外周血中仍可检测到来源于MV的BCR-ABL1mRNA,基于MV检测能够对CMR状态进行进一步分层,避免患者被定义为假阴性CMR而选择停药；Ph+ALL中,MV中的BCR-ABL1水平升高能够早期预测疾病复发,特别对髓外复发具有独特的提示作用。