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研究证明PTPs(protein tyrosine phosphatases,酪氨酸蛋白磷酸酶)在动物细胞信号转导中起重要作用,由于当时植物细胞中尚未发现典型的酪氨酸蛋白激酶,因此人们忽视了植物蛋白质酪氨酸残基磷酸化/去磷酸化的研究,对PTPs在植物细胞中的功能也知之甚少。最近的研究资料表明植物体内确实存在PTPs,目前已在拟南芥基因组中鉴定了20个左右的PTPs基因,发现它们在植物细胞有丝分裂、生长、发育和抗逆性中均发挥重要作用,但PTPs在保卫细胞信号转导中的作用及其机制研究尚少。本文以蚕豆表皮条为试验材料,结合运用激光共聚焦扫描显微镜和PTPs分离、活性检测技术,研究了PTPs在光/暗调控气孔运动中的作用及其与H<,2>O<,2>、NO的关系。
所得实验结果主要如下:
1.光下PTPs专一性抑制剂PAO(phenylarsine oxide)对气孔开度无影响,但暗.中显著促进气孔开放;暗中外源H<,2>O<,2>和NO供体SNP对气孔开度无影响,但光下显著促进气孔关闭。上述结果暗示光下PTPs活性和H<,2>O<,2>、NO水平低而暗中高,PTPs和H<,2>O<,2>、NO参与光/暗对气孔运动的调控。
2.光下H<,2>O<,2>清除剂CAT、ASA和H<,2>O<,2>产生酶NADPH氧化酶抑制剂DPI与PTPs抑制剂PAO对气孔开度无影响,但暗中显著促进气孔开放。此结果暗示PAO可能通过抑制PTPs活性进而调控保卫细胞H<,2>O<,2>水平和气孔运动,而CAT、ASA、DPI可能通过降低保卫细胞H<,2>O<,2>水平进而调控PTPs活性和气孔运动。
3.与H<,2>O<,2>单独处理相较,光下H<,2>O<,2>+PAO、H<,2>O<,2>+ASA、H<,2>O<,2>+CAT处理均使气孔开度显著增大,而H<,2>O<,2>+DPI则无上述效应。
此结果暗示:(1)象H<,2>O<,2>清除剂ASA、CAT一样,PAO可能通过抑制PTPs活性清除H<,2>O<,2>进而促进气孔开放,而H<,2>O<,2>产生酶NADPH氧化酶抑制剂DPI则无上述效应。将此结论与暗中PAO促进气孔开放的结果联系起来考虑,可见暗中PAO通过抑制PTPs活性清除H<,2>O<,2>而非抑制H<,2>O<,2>生成进而促进气孔开放。
(2)象PTPs抑制剂PAO一样, ASA、CAT可能通过清除H<,2>O<,2>抑制PTPs活性进而促进气孔开放,而H<,2>O<,2>产生酶NADPH氧化酶抑制剂DPI则无上述效应。将此结论与暗中ASA、CAT和DPI均促进气孔开放的结果联系起来考虑,可见暗中ASA、CAT通过清除H<,2>O<,2>而DPI通过抑制H<,2>O<,2>生成抑制保卫细胞PTPs活性进而促进气孔开放。
4.H<,2>O<,2>荧光和PTPs活性检测结果表明:(1)保卫细胞内源H<,2>O<,2>水平和PTPs活性光下低而暗中高,表明光确实降低而暗确实提高保卫细胞内源H<,2>O<,2>水平和PTPs活性,光/暗确实通过调节保卫细胞内源H<,2>O<,2>水平和PTPs活性调控气孔运动。(2)PTPs抑制剂PAO不仅明显降低暗处理保卫细胞内源H<,2>O<,2>水平,也明显降低光下外源H<,2>O<,2>处理引起的保卫细胞H<,2>O<,2>水平升高;光下外源H<,2>O<,2>显著提高PTPs活性,暗中H<,2>O<,2>清除剂ASA、CAT和H<,2>O<,2>产生酶NADPH氧化酶抑制剂DPI则显著降低其活性。此结果证明,光/暗调控气孔运动中PTPs确有提高保卫细胞内源H<,2>O<,2>水平的效应,而H<,2>O<,2>则确有提高保卫细胞PTPs活性的效应。
5.光TNO清除剂cPTIO、NO合成酶NOS抑制剂L-NAME和PTPs抑制剂PAO对气孔开度无显著影响,但暗中显著促进气孔开放。此结果暗示PAO可能通过抑制PTPs活性进而调控保卫细胞NO水平和气孔运动,而cPTIO、L-NAME可能通过降低保卫细胞NO水平进而调控PTPs活性和气孔运动。
6.与NO供体SNP单独处理相较,光下SNP+PAO、SNP+cPTIO处理均使气孔开度显著增大,而SNP+L-NAME则无上述效应。此结果暗示:(1)象NO清除剂cPTIO一样,PAO可能通过抑制PTPs活性清除N0进而促进气孔开放,而NO合成酶NOS抑制剂L-NAME则无上述效应。将此结论与暗中PAO促进气孔开放的结果联系起来考虑,可见暗中PAO通过抑制PTPs活性清除NO而非抑制保卫细胞NO合成进而促进气孔开放。(2)象PTPs抑制剂PAO一样,cPTIO可能通过清除NO抑制PTPs活性进而促进气孔开放,而NO合成酶NOS抑制剂L-NAME则无上述效应。将此结论与暗cPTIO和L-NAME均促进气孔开放的结果联系起来考虑,可见暗中cPTIO通过清除NO而L-NAME通过抑制NO合成抑制保卫细胞PTPs活性进而促进气孔开放。
7.NO荧光和PTPs活性检测结果表明:(1)保卫细胞内源NO水平和PTPs活性光下低而暗中高,表明光确实降低而暗确实提高保卫细胞内源NO水平和PTPs活性,光/暗确实通过调节保卫细胞内源NO水平和PTPs活性调控气孔运动。(2)PTPs抑制剂PAO不仅明显降低暗处理保卫细胞内源NO水平,也明显降低光下SNP处理引起的保卫细胞NO水平升高;光下SNP显著提高PTPs活性,暗中NO清除剂cPTIO、NOS抑制剂L-NAME则显著降低其活性。此结果证明,光/暗调控气孔运动中PTPs确有提高保卫细胞内源NO水平的效应,而NO则确有提高保卫细胞PTPs活性的效应。