目的:自二十世纪八十年代以来,钆对比剂被广泛应用于增强磁共振成像(contrast-enhanced magnetic resonance imaging,CE-MRI)检查,是迄今为止最常用的磁共振对比剂。在以往的临床工作中,由于注射钆对比剂引发严重不良反应的机率很低,钆对比剂被认为是一种相对安全的对比剂药物。但自2006年起,许多研究表明肾源性系统性纤维化(nephrogenic systemic fibrosis,NSF)与患者的多次钆对比剂注射史具有密切关系,这一发现使钆对比剂的安全性问题得到业内学者的广泛关注。近期研究表明,对于曾经多次接受静脉注射钆对比剂的患者和动物,在此后相当长的时间内,在其MRI平扫T1加权图像(T1 weighted image,T1WI)上,小脑深部核团(deep cerebellar nucleus,DCN)和苍白球的信号强度明显升高,并且脑组织中仍然能够检测到钆沉积。这种现象更多见于多次应用线型钆对比剂的患者和动物。目前钆在脑部沉积的潜在风险仍需进一步研究,美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)和欧洲药品管理局(European Medicines Agency,EMA)对钆对比剂引起的脑部钆沉积现象予以高度重视,EMA甚至建议在临床工作中停止使用钆双胺和马根维显等高风险线型钆对比剂,以避免钆沉积对脑部产生潜在的损伤。目前,钆进入脑组织并沉积的机制尚不清楚。一种可能的沉积途径是通过血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)渗透到脑内。另一种可能的途径是通过血-脑脊液屏障进入类淋巴系统,从而沉积在脑内。糖尿病是最常见的全球性公共卫生问题之一,作为一种常见的基础疾病,常伴发肿瘤、慢性肝脏疾病和血管性疾病等,因此糖尿病患者往往需要接受多次增强MRI检查。研究表明,糖尿病能够逐渐破坏BBB的完整性和功能。近期研究表明,糖尿病与脑内类淋巴系统的破坏有密切关联。另一方面,糖尿病能够引起多种并发症,如糖尿病肾病。在机体内,钆的清除主要依靠肾脏。糖尿病肾病是肾功能损害的重要原因之一。因此,糖尿病状态可能对钆对比剂在脑部的沉积和清除产生影响。研究糖尿病状态下脑部钆沉积情况和清除情况对于糖尿病患者应用钆对比剂的安全性问题具有重要指导意义。糖尿病作为一种以血糖升高为主要特点的代谢紊乱综合征,能够导致中枢神经系统并发症,引起脑组织损伤和认知功能障碍。研究表明,脑组织损伤的病理学表现为神经元变性、凋亡和胶质细胞的激活增生。HE染色和Nissl染色是两种常用的神经组织学染色方法。在神经元损伤时,HE染色可表现为神经元胞质深染,细胞核空泡样变性、核固缩或核溶解。Nissl染色能够清楚地显示神经元胞体内的尼氏体。在神经元损伤时,Nissl染色可表现为尼氏体数量减少甚至溶解消失,染色变浅。胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)是一种III型中间丝状蛋白,主要分布于中枢神经系统的星型胶质细胞,是星型胶质细胞活化的标志物。在神经元损伤时,GFAP表达升高,提示星型胶质细胞增生。在中枢神经系统,神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)是由成熟神经元和神经元起源细胞持续表达的可溶性胞质蛋白,是一种脑组织特异性糖酵解酶,在细胞能量代谢过程中起到重要作用。在缺血性脑损伤时,可检测到NSE表达升高。迄今为止,尚无关于糖尿病状态对钆对比剂在脑部沉积和清除状况的影响以及钆沉积对糖尿病脑组织损害的相关研究。因此在本文第一部分,我们以正常大鼠和1型糖尿病大鼠模型为基础,应用钆双胺、钆喷酸葡胺两种线型钆对比剂和钆特酸葡甲胺环型对比剂进行干预,采用MRI、电感耦合等离子体质谱仪(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)和透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)技术研究糖尿病状态下脑部各部位钆沉积情况和清除情况,以期阐明糖尿病状态对于脑部钆沉积和清除状况的影响。在本文第二部分,我们以正常大鼠和1型糖尿病大鼠模型为基础,应用钆双胺、钆喷酸葡胺两种线型钆对比剂和钆特酸葡甲胺环型对比剂进行干预,采用HE染色,Nissl染色和GFAP、NSE免疫组织化学染色技术探究钆对比剂沉积对正常大鼠和1型糖尿病大鼠的脑部病理学损害,以期为糖尿病患者应用钆对比剂的安全性问题提供指导。研究方法:第一部分、钆对比剂在1型糖尿病大鼠模型脑部沉积和清除状况的实验研究1、构建1型糖尿病大鼠模型。将糖尿病大鼠(n=52)和正常大鼠(n=52)常规喂养4周。2、将糖尿病大鼠和正常大鼠均随机分为4组:钆双胺组、钆喷酸葡胺组、钆特酸葡甲胺组、对照组(0.9%生理盐水)。对各组大鼠连续5周、每周连续4天尾静脉注射0.6 mmol/kg(1.2 mL/kg)钆对比剂或等量的生理盐水。3、根据大鼠处死时间的不同,将上述每组各分为2个亚组:7 d亚组(末次注射对比剂7 d后处死,n=6)和42 d亚组(末次注射对比剂42 d后处死,n=7)。对于7 d亚组,6只大鼠处死后进行ICP-MS实验,分析脑部各部位钆元素含量。对于42 d亚组,6只大鼠在注射钆对比剂期间和注射后观察期间进行头部T1W MRI平扫扫描,并在处死后进行ICP-MS实验;1只大鼠处死后使用TEM观察钆颗粒的微观分布情况。4、头部T1W MRI扫描与图像定量分析:对于42 d亚组,6只大鼠在注射钆对比剂期间和观察期间每周进行头部T1W MRI扫描与图像定量分析。将感兴趣区(region of interest,ROI)放置在双侧DCN和小脑实质区域,计算DCN的信号强度比值:DCN(两侧的高值)/小脑实质。5、采用微波消解法和ICP-MS实验,分别分析7 d亚组和42 d亚组脑部各部位钆元素含量。6、采用TEM观察42 d亚组脑部钆元素的微观分布情况。第二部分、钆对比剂沉积对1型糖尿病大鼠模型脑部损害的病理学研究1、构建1型糖尿病大鼠模型。将糖尿病大鼠(n=24)和正常大鼠(n=24)常规喂养4周。2、将糖尿病大鼠和正常大鼠均随机分为4组:钆双胺组、钆喷酸葡胺组、钆特酸葡甲胺组、对照组(0.9%生理盐水)。对各组大鼠连续5周、每周4天尾静脉注射0.6 mmol/kg(1.2 ml/kg)钆对比剂或等量的生理盐水。3、在末次注射对比剂42 d后处死大鼠,多聚甲醛灌注后剥离脑组织,切取包含小脑DCN和海马CA3区的4mm典型脑部冠状切片,浸入多聚甲醛固定72 h。4、将固定充分的脑组织进行脱水、透明、并在浸蜡后包埋成石蜡切块。5、对脑组织切片进行HE染色,观察是否存在神经细胞变性、坏死和胶质增生,计数每3.8×10~5μm~2视野内正常存活的神经细胞个数。6、对脑组织切片进行Nissl染色,观察是否存在尼氏体减少,尼氏染色减弱;神经元萎缩和高度嗜碱性。计数每3.8×10~5μm~2视野内异常神经细胞的个数。7、对脑组织切片进行GFAP免疫组织化学染色,计数每9.6×10~4μm~2视野内GFAP阳性细胞的个数。8、对脑组织切片进行NSE免疫组织化学染色,计数每9.6×10~4μm~2视野内NSE阳性细胞的个数。结果:第一部分、钆对比剂在1型糖尿病大鼠模型脑部沉积和清除状况的实验研究在处死动物前,糖尿病大鼠的平均血糖水平显著高于正常大鼠的平均血糖水平(24.6±2.3 vs 5.2±0.4 mmol/L),差异具有统计学意义(p<0.001)。正常大鼠和糖尿病大鼠的钆对比剂注射总量无显著差异(3.44±0.26 vs 3.41±0.31mmol,p=0.988)。在正常大鼠和糖尿病大鼠中,线型对比剂钆双胺组DCN/小脑实质的T1WI信号强度比值从注射第3周(w 7)起显著高于基线水平,并且在停止注射钆双胺的w10至w 14依然持续高于基线水平(p<0.05)。与钆双胺组相比,钆喷酸葡胺组DCN/小脑实质的T1WI信号强度比值升高程度较小。在环型对比剂钆特酸葡甲胺组和生理盐水组,DCN/小脑实质的T1WI信号强度比值与其基线水平相比无统计学差异(p>0.05)。在注射钆双胺的大鼠中,在对比剂注射阶段和注射后观察阶段(w 7-w 14),糖尿病大鼠DCN/小脑实质的T1WI信号强度比值的升高程度均显著低于正常大鼠(p<0.001)。在注射钆喷酸葡胺的大鼠中,从w 8起,糖尿病大鼠DCN/小脑实质的T1WI信号强度比值的升高程度显著低于正常大鼠,并持续至观察期末(w 14)(p<0.001)。在注射环型对比剂钆特酸葡甲胺组的大鼠中,糖尿病大鼠与正常大鼠DCN/小脑实质的T1WI信号强度比值均无明显升高,均维持在基线水平(p>0.05)。在多次静脉注射钆双胺、钆喷酸葡胺和钆特酸葡甲胺7 d和42 d后,糖尿病大鼠脑部平均钆沉积量均显著低于正常大鼠脑部平均钆沉积量,差异具有统计学意义。在正常大鼠和糖尿病大鼠,脑部不同部位钆沉积量呈现相近的分布特点。最高钆沉积量出现在多次静脉注射线型对比剂钆双胺组大鼠的嗅球、DCN和纹状体。在正常大鼠和糖尿病大鼠,多次静脉注射线型对比剂钆双胺引起的脑部平均钆沉积量最多。线型对比剂钆喷酸葡胺引起的脑部平均钆沉积量次之。与线型钆对比剂相比,环型钆对比剂钆特酸葡甲胺引起的脑部平均钆沉积量显著降低。在正常大鼠,与注射对比剂7 d亚组相比,注射对比剂42 d后,线型对比剂和环型对比剂导致的脑部钆沉积量均显著降低,差异具有统计学意义。在糖尿病大鼠,与注射对比剂7 d亚组相比,注射对比剂42 d后,两种线型对比剂导致的脑部钆沉积量无明显降低;对于环型对比剂钆特酸葡甲胺组,在注射对比剂42 d后脑部钆沉积量与7 d后相比明显降低,差异具有统计学意义。在正常大鼠,多次注射线型对比剂钆双胺和钆喷酸葡胺后,在TEM镜下嗅球血管壁内或血管壁周围区域可见黑色浓聚钆颗粒,以钆双胺组浓聚颗粒最多。在糖尿病大鼠,在多次注射线型对比剂钆双胺后,在TEM镜下嗅球血管壁内或血管壁周围区域可见黑色浓聚颗粒。钆双胺组糖尿病大鼠血管周围的浓聚颗粒数量明显少于正常大鼠。第二部分、钆对比剂沉积对1型糖尿病大鼠模型脑部损害的病理学研究正常大鼠各组DCN区正常神经元数量之间无明显统计学差异(p=0.069)。糖尿病大鼠各组DCN区部分神经元胞质深染,部分细胞核消失。糖尿病各组DCN区正常神经元数量之间无明显统计学差异(p=0.458)。正常大鼠各组海马CA3区正常神经元数量之间无明显统计学差异(p=0.057)。糖尿病大鼠各组海马CA3区见大量神经元萎缩,胞质深染,部分细胞核消失。糖尿病各组海马CA3区正常神经元数量之间无明显统计学差异(p=0.222)。正常大鼠各组DCN区神经元结构、形态未见明显异常,尼氏体染色清晰,各组异常神经元数量之间无明显统计学差异(p=0.550)。糖尿病大鼠各组DCN区可见部分神经元尼氏体减少,染色模糊。糖尿病各组DCN区异常神经元数量之间无明显统计学差异(p=0.876)。正常大鼠各组海马CA3区尼氏体染色清晰,少量神经元胞质深染,各组异常神经元数量之间无明显统计学差异(p=0.336)。糖尿病大鼠各组海马CA3区可见大量神经元萎缩,胞质深染,部分细胞核消失。糖尿病各组海马CA3区异常神经元数量之间无明显统计学差异(p=0.400)。正常大鼠各组DCN区GFAP阳性星型胶质细胞形态正常,各组GFAP阳性胶质细胞数量之间无明显统计学差异(p=0.554)。糖尿病大鼠各组DCN区GFAP阳性星型胶质细胞数量增多,呈典型树突样改变。糖尿病各组DCN区GFAP阳性胶质细胞数量之间无明显统计学差异(p=0.440)。正常大鼠各组海马CA3区GFAP阳性星型胶质细胞形态正常,各组GFAP阳性胶质细胞数量之间无明显统计学差异(p=0.456)。糖尿病大鼠各组海马CA3区GFAP阳性星型胶质细胞数量增多,呈典型树突样改变。糖尿病各组海马CA3区GFAP阳性胶质细胞数量之间无明显统计学差异(p=0.992)。正常大鼠各组DCN区NSE染色阳性神经元结构、形态未见明显异常,各组NSE染色阳性细胞数量之间无明显统计学差异(p=0.420)。糖尿病大鼠各组DCN区NSE染色阳性神经元细胞数量增加。糖尿病各组DCN区NSE染色阳性神经元细胞数量之间无明显统计学差异(p=0.839)。正常大鼠各组海马CA3区NSE染色阳性神经元结构、形态未见明显异常(p=0.323)。各组NSE染色阳性细胞数量之间无明显统计学差异。糖尿病大鼠各组海马CA3区NSE染色阳性神经元细胞数量增加。糖尿病各组海马CA3区NSE染色阳性神经元细胞数量之间无明显统计学差异(p=0.834)。结论:1、在多次静脉注射线型钆对比剂(钆双胺、钆喷酸葡胺)和环型对比剂(钆特酸葡甲胺)后,1型糖尿病大鼠的脑部钆沉积量少于正常大鼠。2、多次静脉注射线型钆对比剂的糖尿病大鼠脑部钆沉积量显著多于多次静脉注射环型对比剂的糖尿病大鼠。3、糖尿病状态抑制线型钆对比剂(钆双胺、钆喷酸葡胺)在脑内的清除,而对环型钆对比剂在脑内的清除无显著影响。4、多次静脉注射线型钆对比剂和环型钆对比剂引起的脑部钆沉积均未对正常大鼠引起明显的脑组织病理学损伤。5、多次静脉注射线型钆对比剂和环型钆对比剂引起的脑部钆沉积并未进一步加重1型糖尿病大鼠脑组织的病理学损伤。