随着现代社会的不断发展,生活节奏的不断加快,心理因素在多种疾病发生发展中的重要作用日益受到人们的广泛关注。大量研究证实,心理应激与多种全身性疾病的发生发展存在相关关系。目前,心理应激对口腔颌面部影响的研究已逐渐明确:心理应激可以加重牙周炎发展,延迟口腔黏膜疾病的愈合,甚至引起咀嚼肌肌肉紧张度增高等。然而,口腔颌面部最常见疾病之一的慢性口颌面痛,因其病因复杂、影响因素众多等,其发病机制至今尚未完全阐明。头面部痛觉传导通路的第一级神经元是位于三叉神经节内的假单级神经元,其周围突分布于头面部感受器,中枢突止于三叉神经脊束核。研究表明,三叉神经脊束核尾侧亚核在口颌面部伤害性信息的传递和调节中处于重要地位。基于此,本课题组开展系列研究,并已明确三叉神经脊束核尾侧亚核中的星形胶质细胞在心理应激致咬肌区痛觉敏感过程中发挥着一定的作用。研究也证实,口颌面部受到伤害性刺激后,三叉神经脊束核尾侧亚核中神经元明显活化,且神经元上的谷氨酸NMDA受体在突触传递中发挥重要作用,能够参与神经元-星形胶质细胞间的信号传递。然而,口颌面部疼痛中NMDA受体介导星形胶质细胞活化的具体机制尚未可知。此外,研究表明,神经损伤后脊髓背角内MAPK家族中的JNK成员表达显著上调,且特异分布在星形胶质细胞内。那么,在口颌面部疼痛状态下,三叉神经脊束核尾侧亚核中NMDA受体对JNK的活化是否有一定的作用?基于此,我们设计了如下实验:第一部分:心理应激模型的建立与评价及其对大鼠咬肌痛敏影响的实验研究首先,采用完全随机法将64只大鼠分为:空白对照组,心理应激1天、3天、5天、7天、9天、11天、14天组,每组8只。心理应激组大鼠每天给予8小时束缚应激,对照组大鼠不作束缚处理。结果显示:心理应激能够导致大鼠体重增长量下降;负性情绪增多,表明模型建立成功。随后,采用Von Frey纤维丝对每组大鼠的咬肌区域进行刺激以检测其咬肌区痛觉阈值的变化。结果显示:慢性束缚应激能够使大鼠咬肌区的机械性痛觉阈值明显下降,证实了心理应激与慢性口颌面部疼痛的相关关系。第二部分:NMDA-nNOS-JNK通路在心理应激致大鼠咬肌痛敏中的作用首先采用免疫荧光组织化学方法检测心理应激对大鼠三叉神经脊束核尾侧亚核中Fos蛋白(神经元活化的指标)、GFAP(星形胶质细胞活化的指标)表达的影响。结果显示:束缚应激1天时大鼠Vc内Fos蛋白表达量显著升高,持续一周后逐渐恢复到正常水平,且绝大多数Fos蛋白均表达在Neu N阳性的神经元上;而GFAP则是在束缚应激3天时逐渐升高,7天与14天时显著增多,提示束缚应激刺激可以有效激活三叉神经脊束核尾侧亚核中神经元及星形胶质细胞。为进一步证实Vc内的神经元与星形胶质细胞在心理应激致大鼠咬肌区痛觉敏感中的作用,我们将每个应激组又分为3个亚组,每组4只动物,分别给予生理盐水(对照组)、ASO(阻断Fos蛋白)、LAA(阻断GFAP),于每日上午束缚前10分钟给药,1次/天,给药天数同束缚天数,考虑到药物的持续作用,14天组只连续给药11天,后3天只给予束缚处理。每个亚组于处理前、处理相应的天数结束后进行痛觉阈值测定,并进行免疫荧光染色检测。结果显示:两种阻断剂均可显著缓解应激导致的大鼠咬肌区痛觉敏感现象,且ASO明显抑制束缚应激后Vc内Fos蛋白与GFAP的表达,LAA能够抑制束缚应激后Vc内GFAP的表达上调,并缩短Fos蛋白的表达时程。以上结果提示,心理应激可以导致大鼠Vc内神经元与星形胶质细胞活化,且神经元的活化早于星形胶质细胞的活化,而星形胶质细胞的活化不仅作为神经元活化的下游现象,并可能影响神经元活化,二者相互作用,促进心理应激致大鼠咬肌区痛觉敏感的发展。随后,我们对心理应激后Vc内神经元与星形胶质细胞间相互作用的分子机制进行了研究。为探明星形胶质细胞内JNK的活化是否参与心理应激致大鼠咬肌区痛觉敏感的过程,我们在建模14天后采用免疫荧光组织化学技术和Western blotting技术检测pJNK的表达情况以及其与GFAP是否共存,之后通过鞘内置管给予JNK抑制剂并检测给药后咬肌区痛觉阈值的变化。结果显示:束缚应激14天后,pJNK表达显著升高,且其与GFAP几乎完全共存,Western blotting结果也表明,束缚应激后pJNK-1表达水平显著升高,且JNK抑制剂能显著抑制应激大鼠的咬肌区机痛觉敏感。上述研究证实,星形胶质细胞内JNK的活化在心理应激致大鼠咬肌区痛觉敏感过程中起关键作用。此外,我们进一步探讨了神经元上的NMDA受体是否参与心理应激致大鼠咬肌区痛觉敏感及诱导星形胶质细胞内JNK的活化过程。束缚应激14天后采用免疫荧光组织化学检测NR2B与NeuN的双标情况、GFAP与NR2B的双标情况,并采用Western blotting检测pNR2B的表达情况;之后通过鞘内置管给予拮抗剂MK-801(阻断NMDA)、ifenprodil(阻断NR2B)与生理盐水后检测大鼠咬肌区痛觉阈值的变化,并通过Western blotting检测给药后pJNK的表达变化。结果发现,NR2B亚单位与神经元标记物NeuN大量共存,且束缚应激后NR2B亚单位磷酸化水平显著高于对照组。此外,两种抑制剂不仅可以缓解应激大鼠咬肌区痛觉敏感,还能显著抑制应激后JNK的磷酸化。以上结果说明,神经元上的NMDA受体参与心理应激致大鼠咬肌区痛觉敏感的传导,并能诱导星形胶质细胞中JNK的活化。为进一步探讨NMDA诱导的JNK活化是否依赖于nNOS-GC-cGMP途径,我们于束缚应激14天后鞘内给予nNOS抑制剂7-NINA及GC抑制剂ODQ后检测大鼠咬肌区痛觉阈值的变化,并通过Western blotting检测给药后pJNK的变化。结果显示:鞘内给予7-NINA与ODQ均能有效缓解束缚应激诱导的大鼠咬肌区痛觉敏感,且7-NINA与ODQ处理均能显著抑制pJNK的表达水平。该结果表明束缚应激后NMDA诱导星形胶质细胞JNK的活化依赖于nNOS-GC途径。研究结论:1、束缚应激可以引起动物机体一系列应激性变化,产生心理应激状态,应用束缚应激可以有效建立慢性心理应激动物模型。2、心理应激能够降低大鼠咬肌区机械性痛觉阈值,证实了心理应激与慢性口面部疼痛的相关关系。3、心理应激能够引起三叉神经脊束核尾侧亚核中神经元与星形胶质细胞活化,且阻断二者的活化均能够缓解咬肌区痛觉敏感,同时分别下调对方的活性,说明,在心理应激致大鼠咬肌区痛觉敏感的过程中,神经元与星形胶质细胞二者相互作用,促进咬肌区痛觉敏感的发生发展。4、心理应激后三叉神经脊束核尾侧亚核星形胶质细胞内JNK明显活化并参与心理应激诱导的咬肌区痛觉敏感;神经元上的NMDA受体以细胞间的间接作用方式参与星形胶质细胞内JNK的活化;心理应激诱导的JNK活化依赖于nNOS-GC;提示NMDA-nNOS-JNK通路在心理应激致大鼠咬肌区痛觉敏感的过程中发挥关键作用。