双酚A(Bisphnol A,BPA)是一种环境雌激素，属于环境内分泌干扰物，研究表明BPA具有类雌激素与抗雄激素的生物学作用。BPA作为生产聚碳酸酯、环氧树脂等聚合物的重要原料被广泛应用于生产生活中，人类可经过消化道、呼吸道和皮肤等途径暴露于BPA。目前很多研究表明，BPA具有明显的雄性生殖毒性作用，它可引起雄性啮齿动物雄激素合成下降、精子生成减少、支持细胞形态结构改变，血睾屏障破坏等，进而导致雄性动物生殖能力下降。本研究通过体外分离培养睾丸支持细胞，观察BPA对支持细胞的毒性作用，研究与细胞凋亡有关的JNK、P38MAPK信号转导通路在此过程中的调控作用。从细胞信号转导通路的角度研究BPA对支持细胞的毒性机制，这是本实验的创新点。　　第一部分：大鼠睾丸支持细胞的分离培养及BPA对支持细胞活力的影响　　目的：①确定和完善大鼠睾丸支持细胞的体外培养方法，以获得纯度较高的支持细胞。探讨BPA对体外培养支持细胞活力的影响，并确定BPA的作用剂量。　　方法：①在本实验室前期支持细胞培养方法上加以改进，采用两酶三步消化法获得纯度较高的支持细胞进行培养。②对离体培养的支持细胞分别用30、50、70和90μmol/L的BPA染毒24h后用MTT比色法测其在490nm波长下的吸光度值，根据吸光度值计算细胞存活率。　　结果：与溶剂对照组相比，50、70、90μmol/LBPA均使细胞吸光度值明显下降（P<0.05）；细胞存活率随染毒剂量的增加而逐渐下降，70μmol/LBPA剂量组的细胞存活率为75.81％，因此以此剂量为最高剂量，确定BPA染毒浓度分别为0、30、50、70μmol/L。　　结论：①本研究中的支持细胞培养方法可以获得纯度较高、生长状态良好的睾丸支持细胞。?BPA可使体外培养的支持细胞活力下降，对支持细胞具有一定的细胞毒性作用。③明确了后续研究的最高染毒浓度为70μmol/LBPA。　　第二部分：BPA对支持细胞凋亡关键基因和蛋白的影响　　目的：观察BPA染毒支持细胞24h后，细胞凋亡相关基因fasL、TNF-α和caspase3 mRNA及caspase3酶原蛋白在支持细胞中的表达变化，以研究BPA对支持细胞凋亡作用的影响。　　方法：用Real time-PCR(RT-PCR)法检测支持细胞内fasL、TNF-α和caspase3 mRNA的相对表达情况；用Western blotting法检测Procaspase3蛋白的表达情况，用免疫细胞化学方法观察细胞形态变化以及Procaspase3在细胞中的定位和定性表达情况。　　结果：与溶剂对照组相比，细胞凋亡相关基因fasL mRNA的表达量在50、70μmol/LBPA剂量组明显增加（p＜0.05）、TNF-α在50μmol/LBPA剂量组明显增加；各剂量的BPA均使caspase3 mRNA相对表达量明显上升（p＜0.05）。70μmol/LBPA剂量组Procaspase的表达量与溶剂对照相相比显著降低（p＜0.05），免疫细胞化学的结果显示，70μmol/LBPA使支持细胞轮廓不清，细胞间界限不明显，细胞形态被破坏；Procaspase3位于细胞质中，其表达量有随着染毒剂量的增加而逐渐减少的趋势。　　结论：FasL与Fas结合后，募集细胞内死亡信号分子组成死亡诱导信号复合体（Death inducing signaling complex，DISC），通过caspase途径最终激活凋亡执行蛋白caspase3,该蛋白的激活意味着细胞凋亡的不可逆转性，BPA可导致FasL的表达增加，激活caspase3，导致细胞凋亡，支持细胞数量的减少可能是BPA所引起生殖毒性的一个重要机制。　　第三部分：BPA对支持细胞中JNK和P38信号转导通路的影响　　目的：探讨BPA染毒支持细胞24h后，JNK和P38 MAPK信号转导通路的表达变化　　方法：BPA染毒离体培养的支持细胞24h后，①用RT-PCR法检测细胞中JNK信号通路关键基因ASK1、MKK7、JNK1、c-jun和 P38MAPK信号转导通路关键基因p38、CHOP、CREB mRNA的相对表达情况；②用Western blotting方法检测细胞中JNK、磷酸化JNK(Phosphorylated JNK,P-JNK)、P38、磷酸化P38(Phosphorylated P38,P-P38)的蛋白相对表达量。　　结果：①与溶剂对照组相比，ASK1 mRNA的相对表达量在70μmol/LBPA剂量组显著增加（p＜0.05）；MKK7 mRNA的相对表达量在各剂量组均有明显下降（p＜0.05）；JNK1的表达量无明显变化；c-jun mRNA的相对表达量随染毒剂量的增加而逐渐增加，50、70μmol/LBPA剂量组表达量与溶剂对照组的差异具有显著性意义（p＜0.05）。与溶剂对照组相比，30μmol/LBPA可使p38 mRNA的表达量明显增加（p＜0.05），而50μmol/LBPA使p38的表达量明显降低（p＜0.05），70μmol/LBPA无明显变化；CHOP和CREB的表达量在BPA各剂量组均显著增加（p＜0.05）;②与溶剂对照组相比，JNK蛋白相对表达量各剂量组无明显变化，70μmol/LBPA可使P-JNK的相对表达量明显增高（p＜0.05）；P38的表达量在各剂量组也无明显差异，P-P38在50、70μmol/LBPA剂量组的相对表达量与溶剂对照组的差异具有显著性意义（p＜0.05）。　　结论：BPA作用下，支持细胞中JNK和P38被激活，ASK1 mRNA的表达量也明显增高，信号通路下游基因c-jun、CHOP和CREB表达上调，表明BPA可激活JNK和P38信号转导通路。