在人类生产生活中,滥用抗生素引起了细菌抗药性的增强,导致产生了超级耐药细菌。其典型例子是,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)和耐万古霉素肠球菌(vancomycin-resistant Enterococcus, VRE)的爆发。MRSA是一种最致命的超级耐药细菌,它能导致心内膜炎、肺炎和败血症等疾病。从发现至今,MRSA感染几乎遍及全球,已成为医院内和社区感染的重要病原菌之一。VRE属于肠球菌属,对多种抗生素均有耐药性,尤其是万古霉素。VRE的感染也造成许多致命的健康问题,如多器官功能障碍综合征(multiorgan dysfunction syndrome, MODS)、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS),失血性休克和肺炎等。由此可见目前人类迫切需要开发更有效的新型抗菌剂来治疗MRSA和VRE的感染。近年来,蝎毒液已被证明是一个丰富的抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPS)的来源。抗菌肽在新的抗菌药物开发研究中备受关注,因为它可以杀死多重耐药性病原菌。抗菌肽具有广谱抗菌活性、不易产生耐药性和毒性低等特点。目前,已发现至少60多种蝎毒素抗菌肽。实验证明,这些抗菌肽均可以杀死革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌、真菌、病毒和肿瘤细胞。我们采用转录组学方法,从非洲黄爪蝎(Opistophthalmw glabrifrons)毒腺cDNA文库中随机挑选了80个克隆子进行测序。除去低质量的序列,共获得了66条有效序列进行分析。其中38个克隆子编码毒素多肽,28个克隆子编码细胞蛋白(非毒素)。对这些新毒素多肽进行序列分析得到19个新多肽(包含2个钾毒素、1个阴离子多肽和16个抗菌肽)。根据这些多肽的序列同源性,我们将获得的多肽分为4个不同的家族：蝎短链钾离子通道毒素(Short-chain potassium channel toxins, ScKTxs)、蝎长链钾离子通道毒素(Long-chain potassium channel toxins, LcKTxs)、蝎抗菌肽(Antimicrobial peptides)和蝎阴离子多肽(Acidic peptides)。其中抗菌肽丰度最高,总共获得了16个新的抗菌肽。我们鉴定到了1个阴离子多肽,命名为Osa-1。Osa-1的前体由76个氨基酸残基组成,信号肽和成熟肽分别由24、52个氨基酸残基组成。在毒素多肽序列中鉴定到的钾毒素有2个,其中一个为长链钾毒素(OsKTx-1),一个为短链钾毒素(OsKTx-2)我们对从非洲黄爪蝎毒腺中分离出的一个新的抗菌肽Opisin进行了功能研究。Opisin前体由22个氨基酸残基的信号肽、19个氨基酸残基的成熟肽和35个氨基酸残基的前肽组成。它是一种阳离子两亲性α-螺旋分子。多序列同源性分析结果表明,Opisin与从Mesobuthus eupeu中分离的Meucin-18、Mesobuthus gibbosus中分离的Megicin-18、 Mesobuthus martensii中分离的Marcin-18、Isometrus maculate中分离的Imcroporin、 Androctonus crassicauda中分离的AcrAP2、Tityus Costatus中分离的Clone5和Clone6的同源性为42.1～15.8%之间。Opisin还与从Mesobuthus martensii Karsch中分离的Bmkb1和Bmkb2、Androctonus amoreuxi中分离的AamAP1和AamAP2、Androctonus crassicauda中分离的AcrAP1、T. Costatus中分离的Clone4、Tityus serrulatus中分离的TsAP-1和TsAP-2、Chaerilus Tricostatus中分离的Ctriporin、Lychas mucronatus中分离的Mucroporin有15.0～5.3%的同源性。Opisin对5种革兰氏阳性菌的抗菌活性分别进行检测(i)S. Aureus (AB 94004), (ii) Bacillus megaterium (AB 90008), (iii) Bacillus thuringiensis (AB 93100), (iv) Nocardia corallina (AA 92100), 和(v) Micrococcus luteus (AB 2010179)。我们发现Opisin能够有效地抑制S. Aureus和N. corallina生长,其MICs值分别为4.0和4.0μM。Opisin对B. Thuringiensis (MIC 6.0μM), M. Luteus (MIC 8.0 μM)和B. Megaterium (MIC 10.0 μM)具有较弱的抗菌活性。我们同样测试了Opisin对7个革兰氏阴性菌的抗菌活性(i) E. coli DH5a, (ii) Pseudomonas putida, (iii) Pseudomonas aeruginosa (AB 93066), (iv) Enterobacter cloacae (AB2010162), (v) Klebsiella oxytoca (AB 2010143), (vi) Pseudomonas fluorescens, (vii) Salmonella enterica (AB 2010185)和(viii)真菌Candida tropicalis AY91009。我们发现Opisin对E. coli DH5a, P. Putida和P. aeruginosa AB 93066具有中等的抗菌活性,MIC值分别为20.0、20.0和20.0μM。然而,抗菌肽Opisin的浓度为少于等于38.2μM时,对E. Cloacae、. S. Enterica、K. Oxytoca和P. Fluorescens没有明显的抗菌活性。抗菌肽Opisin还能有效抑制真菌C. tropicalis AY 91009的生长,MIC值为20.0μM。因此,Opisin对革兰阳性菌的抗菌活性高于革兰阴性菌。有趣的是,Opisin能够有效抑制多重耐药菌的生长,如对耐甲氧西林菌株MRSA和耐万古霉素肠球菌菌株VRE。实验结果表明,Opisin对Sau有很强的抗菌活性,其MIC值为2.0μM；它同样对被测试的其他耐甲氧西林菌株有很强的抗菌活性,包括16436、16465、16558、16559、16585和16760,其MIC值均为4.0 μM。Opisin对耐万古霉素肠球菌菌株也有很强的抗菌活性,对菌株E147、E161、E179、S13、E11、E128和E156的MIC值分别为4.0、4.0、4.0、4.0、6.0、6.0和6.0μM。因此,Opisin能用于有关治疗MRSA以及VRE感染的药物开发,为棘手的人类耐药菌引起的疾病的治疗提供新的思路。以Opisin为模板,选取影响抗菌肽抑菌活性的净电荷和疏水性这两个重要参数为改变对象,设计一系列的抗菌肽,进一步测定它们的抑菌活性,总结电荷、疏水性与肽抗菌活性之间的规律。母肽Opisin的两个丙氨酸(A)均替换成具有强疏水性的亮氨酸(L),合成出抗菌肽Opisin_M1。同时,把母肽Opisin的较弱疏水性的两个甲硫氨酸(M)替换成较强疏水性的亮氨酸(L),合成出抗菌肽Opisin_M2。抗菌实验结果表明Opisin_M2对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均有抗菌活性。在试验的革兰氏细菌之中,Opisin_M2对Staphylococcus aureus AB 94004, Nocardia corallina AA 92100, Bacillus thuringiensis AB93100和Micrococcus luteus AB 2010179有显著的抑菌效果,最小抑菌浓度均为4.0μM。Opisin_M3是通过将Opisin α-螺旋结构的极性面中的甘氨酸(G)、色氨酸(W)和丝氨酸(S)均替换成具有正电荷的赖氨酸(K),非极性面不变设计而成的衍生肽。Opisin_M4是通过将Opisin α-螺旋结构的极性面中的色氨酸(W)替换成具有正电荷的赖氨酸(K)非极性面不变设计而成的衍生肽。Opisin_M5是通过将Opisin α-螺旋结构的极性面中的色氨酸(W)和丝氨酸(S)均替换成具有正电荷的赖氨酸(K),非极性面不变设计而成的衍生肽。抗菌实验结果表明Opisin_M4和Opisin_M5对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均有抗菌活性。在试验的革兰氏细菌之中,Opisin_M4和Opisin_M5对Micrococcus luteus AB 2010179, Bacillus megaterium AB 90008和Escherichia coli DH5a有显著的抑菌效果,最小抑菌浓度都分别为4.0 μM、4.0 μM和8.0μM。最后我们把Opisin抗菌肽分子疏水面的疏水性比较低的丙氨酸(A)替换成疏水性最强的异亮氨酸(I),合成衍生肽Opisin_M6。再以Opisin作为模板,删除S尾巴,合成衍生肽Opisin_M7。抗菌实验结果表明Opisin_M6和Opisin_M7对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均有抗菌活性。在试验的革兰氏细菌之中,Opisin_M6和Opisin_M7都对Nocardia corallina AA 92100, Bacillus thuringiensis AB93100和Escherichia coli DH5a有显著的抑菌效果,最小抑菌浓度都分别为4.0 μM、4.0μM和8.0μM。此外,衍生肽Opisin_M3、Opisin_M4和Opisin_M5在活性浓度范围内溶血率低于10%。综上,肽的抑菌活性与肽的疏水性、净电荷数量以及二级结构等参数密切相关。通过序列同源性搜索从Centruroides exilicauda基因组序列筛选到一个新的抗菌肽CeAP1。CeAP1前体由22个氨基酸残基组成的信号肽序列,17个氨基酸残基组成的成熟肽序列以及35个氨基酸残基组成的前肽序列组成。CeAP1与其它蝎源阳离子短链抗菌肽序列同源性范围是82%～42%。抗菌谱结果显示CeAP1主要作用于革兰氏阳性菌,其对耐药菌MRSA和VRE的MIC值在16～32μM之间。CeAP1溶血活性适中,对人红细胞的Hc50为52μM。分子进化分析结果显示短链阳离子抗菌肽普遍存在于不同蝎种毒液中,CeAP1与其它来源于新大陆蝎种多肽聚在一起,表明短链阳离子抗菌肽基因出现在蝎毒液的时间早于新世界和旧世界蝎种物种分歧时间。氨基酸位点选择压力分析结果显示,蝎短链阳离子抗菌肽基因整体存在很强的进化选择,不同方法共检测到两个负选择位点和一个正选择位点。这些位点为设计新的抗菌肽突变体提供了新的理论基础和分子依据。