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急性髓细胞白血病(acute myelogenous leukemia,AML)是一种血液系统恶性克隆性疾病,主要特征为细胞增殖过度和分化受阻。根据细胞中特殊的基因遗传学改变及细胞不同分化阶段可分为M0-M7八个亚型。其中急性髓细胞部分成熟型白血病和急性早幼粒细胞白血病(APL)分别属于M2和M3型。目前,对于如何治疗白血病患者提高其完全缓解率和无病生存期仍然是研究的热点。虽然分子靶向治疗取得很大进展,但临床上逐渐出现了耐药性,并且耐药机制仍未明确。全反式维甲酸(ATRA)通过诱导APL细胞发生分化,取得了显著的治疗效果,但治疗过程中伴随着并发症的发生。因此,对于急性髓系白血病治疗的探索仍然是一个艰巨的任务。HDN-1是从南极来源的真菌Oidiodendron truncatum GW3-13中提取获得的含有硫桥结构的具有自主知识产权的多硫代二酮哌嗪类(ETPs)化合物。实验室在前期研究中发现HDN-1能跟热休克蛋白Hsp90-C端结合,引起顾客蛋白的降解。在此基础上,本文系统的评价了HDN-1对肿瘤细胞的增殖抑制作用,发现HDN-1对急性髓细胞部分成熟型白血病细胞HL-60抑制效果最为显著,因此,本文进一步在体外细胞水平和体内动物水平对HL-60细胞生长抑制的机制进行探讨。一、HDN-1诱导HL-60细胞凋亡1、MTT法检测HDN-1对多种肿瘤细胞的增殖抑制作用。结果表明,HDN-1对肝癌,肺癌,乳腺癌等肿瘤细胞的半数抑制浓度IC50值在0.03 μmol·L-1～3μmol·L-1范围内,对白血病细胞HL-60的作用最强,IC50值为38nmol·L-1。小鼠免疫细胞增殖抑制实验结果表明,HDN-1对正常的淋巴免疫细胞没有生长抑制作用。说明HDN-1在体外具有广泛的抗肿瘤活性,对HL-60细胞尤为敏感,并且有一定的细胞选择性,不影响机体免疫细胞活力与T、B细胞的免疫功能。2、Hoechst 33342染色发现HDN-1可以诱导HL-60细胞核固缩、碎裂,出现凋亡小体浓染。基因组DNA琼脂糖电泳发现HDN-1将HL-60细胞的DNA切割成倍于180-200bp大小的DNA片段,表明HDN-1可以诱导HL-60细胞发生凋亡。采用蛋白印迹法(Western Blotting)对HL-60细胞凋亡的机制进一步探究,结果显示,不同浓度的HDN-1作用HL-60细胞24h后,细胞内Caspase-8、Caspase-9、 Caspase-3、PARP等凋亡相关蛋白出现剪切条带,Caspase特异性的抑制剂可以恢复HDN-1抑制的HL-60细胞增殖,恢复率可达50%-90%。说明HDN-1诱导HL-60细胞发生依赖Caspase途径的凋亡。在HDN-1作用的HL-60细胞中,促凋亡蛋白Bax表达量增多,凋亡抑制蛋白Bcl-2、Mcl-1表达减少,DNA断裂标志性蛋白y-H2AX表达量增多。说明,HDN-1诱导HL-60细胞发生凋亡是通过线粒体途径和死亡受体途径共同完成的。二、HDN-1诱导HL-60细胞分化1、吉姆萨染色结果显示,HDN-1能够改变HL-60细胞核形态,降低核质比,细胞核逐渐变为肾形和分叶核状。通过过糖原染色(PAS)过碘酸-雪夫氏反应检测细胞内糖原变化发现,HDN-1时间剂量依赖性的增加HL-60细胞内PAS阳性率,提示HDN-1可以诱导HL-60细胞发生分化。2、流式细胞技术检测细胞表面特异性抗原的表达发现,HDN-1可以诱导粒细胞表面抗原CD11b和髓系白血病特异标志抗原CD13的表达量增高,呈CD13hi/CD11b+的变化趋势,而单核细胞特异抗原CD14未发生明显变化,说明HDN-1诱导HL-60细胞发生分化是向着成熟粒细胞方向进行的。3、通过吉姆萨染色和PAS染色比较了HDN-1与全反式维甲酸(ATRA)对HL-60细胞的分化诱导作用。染色和统计结果表明,HDN-1可以在更短的时间,更低的浓度下诱导HL-60细胞发生分化。说明,HDN-1比ATRA在诱导HL-60细胞分化方面更有优势。4、联合HDN-1与ATRA共同作用于HL-60细胞,联合指数C1=0.51<1,等效线图解法分析结果表明,两种化合物联用的多个IC50值均位于等效线的左下方,说明HDN-1与ATRA联合对HL-60细胞的增殖抑制是协同作用。三、HDN-1的体内药效学研究本部分实验成功建立了急性髓细胞白血病部分成熟型细胞HL-60的NOD-SCID小鼠皮下异种植瘤模型,并通过预实验设计方案,设置空白组、溶剂组、HDN-1高、低剂量组(1mg/kg,0.5mg/kg),静脉注射,连续给药12天。实验结果显示HDN-1高、低两个剂量的抑瘤率分别是18%和46%,说明HDN-1可以抑制HL-60移植瘤的生长,且对小鼠体重的影响较小。四、HDN-1对HL-60细胞诱导分化和凋亡的机制研究(1)Hsp90发挥分子伴侣作用需要辅分子伴侣的存在,Hsp70是Hsp90重要的共分子伴侣之一,Hsp70能与Hsp90-C端结合,形成蛋白修饰复合体,行使Hsp90分子伴侣的功能,本部分实验通过免疫共沉淀方法考察了HDN-1对HL-60细胞内Hsp90与Hsp70的结合情况,证实HDN-1可以抑制Hsp90与Hsp70的结合,说明HDN-1在白血病细胞中仍然与Hsp90-C端相结合,抑制Hsp90加工顾客蛋白的功能。(2)存在于白血病中的Hsp90顾客蛋白很多,为进一步考察HDN-1抗白血病的机制,通过Western Blot方法检测了白血病细胞中与细胞凋亡分化相关的Hsp90顾客蛋白的表达,结果表明HDN-1引起了细胞中Akt、p-Akt、Erk、 p-Erk、CyclinD1、Bcr-Ab1、Stat3、p-Stat3等蛋白的降解和活性抑制,从而使得下游信号分子发生改变,提示这可能是HDN-1诱导白血病细胞发生凋亡和分化的机制。综上所述,HDN-1具有广谱的抗肿瘤活性,对于急性髓性白血病细胞HL-60作用尤为敏感,HDN-1与ATRA联用对HL-60细胞的生长增殖作用更强,两种化合物表现为协同作用。HDN-1可以诱导HL-60细胞发生调亡和成熟粒细胞方向的分化,这是首次发现ETP类化合物能够诱导白血病细胞分化,并且与ATRA进行比较发现,HDN-1能够在更短的时间更低的浓度下诱导HL-60细胞分化。HDN-1在动物体内可以显著抑制小鼠HL-60白血病皮下移植瘤的生长,而HDN-1对于白血病的抑制可能是通过与Hsp90相结合抑制Hsp90顾客蛋白中与分化凋亡相关的蛋白的表达实现的。这为今后进一步研究HDN-1的抗白血病机制提供了有效的数据依据,为ETP类化合物的成药性开发奠定基础。