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宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,其发病率逐年上升、发病年龄呈年轻化的趋势。晚期或复发性宫颈癌的预后很差,其临床治疗多采用手术、化疗或放疗等综合性治疗,虽然能够取得一定的临床疗效,但由于病灶容易转移和复发,最终的治疗效果仍不理想,且伴有严重的不良反应。因此,寻找新的治疗方法势在必行。新生血管是肿瘤赖以生长的基础。肿瘤组织必须依赖血管提供营养,才能维持其生长,并实现瘤灶的血行性播散。一氧化氮(nitric oxide, NO)是促进肿瘤血管形成的细胞因子,iNOS作为NO合成的关键酶,在多种恶性肿瘤中呈高表达,催化合成大量的NO,促进肿瘤血管的形成,影响肿瘤细胞的生长。既往的研究均表明iNOS的表达与肿瘤侵袭、转移等密切相关。同样,在宫颈癌组织中,iNOS的高表达与恶性程度和淋巴结转移成正相关。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF) VEGF是已知的、肿瘤新生血管形成最重要、作用最强的细胞因子,iNOS通过NO介导,在诱导VEGF促内皮细胞迁移和血管生成过程中发挥作用。RNA干扰(RNA interfcrence, RNAi)是一种新近发展起来的基因沉默技术,由双链RNA (dsRNA)引发,导致同源mRNA降解,从而阻止目的基因的表达。慢病毒作为一种介导siRNA或shRNA的较理想的载体,目前在干扰技术中被广泛应用。据此,采用RNA干扰技术抑制iNOS目的基因的表达,降低NO的合成,进而下调VEGF水平,抑制肿瘤血管生成,为中晚期宫颈癌的治疗模式提供新的思路和理论依据。本课题分为三大部分：1、iNOS基因RNAi慢病毒载体的构建；2、iNOS-shRNA感染宫颈癌细胞株SiHa和HeLa的体外研究；3、iNOS-shRNA对宫颈癌SiHa和HeLa细胞株生长影响的体内研究。第一部分：iNOS基因RNAi慢病毒载体的构建及感染宫颈癌SiHa和HeLa细胞株[目的]体外构建iNOS基因RNAi慢病毒载体,感染宫颈癌SiHa和HeLa细胞株。[方法]根据iNOS基因序列设计三条iNOS-shRNA,分别构建3个shRNA’慢病毒表达载体,转化感受态细胞,并通过PCR和测序进行鉴定。经鉴定正确后分别转染293T细胞,进行慢病毒包装,继而感染宫颈癌SiHa和HeLa细胞株,后采用Western blot检测目的蛋白的表达情况,判断不同靶点的干扰效果。并采用荧光定量PCR技术进一步验证干扰结果。[结果]PCR和测序证明质粒构建成功。感染宫颈癌SiHa和HeLa细胞后,鉴定出目的细胞的iNOS基因在mRNA水平和蛋白水平的表达均明显下降。[结论]构建的iNOS-shRNA慢病毒载体,感染宫颈癌细胞株SiHa和HeLa后,iNOS基因无论在mRNA水平还是在蛋白水平,其表达均明显下降,从而证实了此表达载体的干扰效果。第二部分慢病毒载体iNOS-shRNA感染宫颈癌细胞株的体外研究[目的]观察iNOS-shRNA对宫颈癌细胞株SiHa和HeLa生长的影响,并在干扰后加入外源性不同浓度NO供体,探讨iNOS, NO与VEGF的相关性。[方法]将宫颈癌细胞株SiHa和HeLa分为三组,第一组感染iNOS-shRNA(干扰组),第二组感染随机序列(阴性对照组),第三组未做处理(空白对照组)。MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡。Griess法检测细胞上清的NO含量,ELISA检测细胞上清液VEGF的水平,Real-timePCR和Western blot分别检测各组细胞iNOS, VEGFmRNA和蛋白表达水平。阴性对照组和干扰组分别加入不同浓度NO供体-硝普钠(SNP), ELISA检测细胞上清液VEGF的水平,Real-time PCR和Western blot分别检测iNOS, VEGFmRNA和蛋白表达水平。[结果]干扰组增殖速率降低,凋亡率增加,与阴性对照组和空白对照组相比,差异有统计学意义。干扰组细胞上清液NO和VEGF的水平明显降低,iNOS, VEGF的mRNA和蛋白表达水平均显著下降,与其他两组相比,差异有统计学意义。阴性对照组和干扰组分别加入不同浓度SNP, SNP在0-0.5mmol/L的浓度范围,细胞上清液VEGF, VEGFmRNA和蛋白水平渐进性增加,且在SNP浓度为0.5mmol/L时达到峰值,SNP浓度继续增至1.0mmol/L时,细胞上清液VEGF和VEGFmRNA和蛋白水平均回落。加入不同浓度SNP, iNOS的mRNA和蛋白水平变化无统计学意义。[结论]iNOS基因干扰后,宫颈癌细胞株SiHa和HeLa的生长受到抑制,细胞分泌NO和VEGF减少；iNOS和VEGF密切相关,iNOS对VEGF的作用是通过NO介导的。加入外源性NO后,在较低浓度范围,能调节VEGF水平。第三部分iNOS-shRNA对宫颈癌细胞株(SiHa和HeLa)生长影响的体内研究[目的]探讨iNOS被干扰后对人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响以及iNOS、 VEGF表达变化的关系,进一步验证前期试验的结果。[方法]体外培养宫颈癌细胞株SiHa和HeLa细胞,然后制成细胞悬液,注射于裸鼠前腋侧皮下,观察肿瘤形成,大小和重量变化。至移植肿瘤25天后牺牲裸鼠,取肿瘤组织做病理切片,用免疫组化法测各组肿瘤iNOS和VEGF的表达。[结果]裸鼠皮下形成移植瘤,随着时间延长逐渐增大。而干扰组肿瘤体积和重量小于对照组；其肿瘤组织的iNOS和VEGF的表达弱于对照组。[结论]干扰后宫颈癌细胞系在裸鼠体内成瘤能力低于对照组,iNOS和VEGF的表达均下降。