论文部分内容阅读
肺癌目前是全球发病率及死亡率最高的恶性肿瘤。肺癌按组织病理学主要分成两大类：非小细胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）和小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC），其中NSCLC占肺癌的80%~85%，其中肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）占NSCLC的一半以上。随着肺腺癌治疗方法的革新，除手术治疗、放射治疗、传统化疗外，靶向治疗和免疫检查点抑制剂等的应用，使非小细胞肺癌患者的总生存期（overall survival，OS）得到显著延长。由于肺癌早期症状的隐匿性并且进展迅速，缺乏有效的标志物，并且容易出现复发转移，其远期疗效并不令人满意。肺腺癌的生物学行为十分复杂，深入研究肺腺癌的发病机制，探寻更有效的治疗手段，对改善肺腺癌患者的预后具有重要意义。
长非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNAs）是新近发现的一类非编码RNA（noncoding RNA,ncRNA）转录本，其长度约大于200个核苷酸。LncRNAs参与多种生物学过程，包括转录或转录后、表观遗传改变和mRNA处理。LncRNAs的失调与肿瘤发生、发展、转移、预后密切相关，可作为多种人类癌症的诊断或预后标志物或者靶向药物的重要靶点。
LncRNATMPO反义RNA1（TMPO antisense RNA1,TMPO-AS1）基因位于12号染色体，在人类疾病中很少报道。既往研究表明TMPO-AS1在包括肺癌在内的部分肿瘤中表达异常，并可促进肿瘤增殖。然而，TMPO-AS1在肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）中的具体作用及其分子机制尚不清楚。因此，我们的研究主要集中于TMPO-AS1在LUAD中的功能作用和其潜在作用机制。
本实验研究分为以下三个部分：第一部分肺腺癌中LncRNA TMPO-AS1的表达及意义；第二部分LncRNA TMPO-AS1对肺腺癌细胞功能的影响及体内实验；第三部分LncRNATMPO-AS1在肺腺癌中的机制探索。
第一部分 肺腺癌中LncRNATMPO-AS1的表达及意义
方法：
1.下载癌症基因组图谱计划（TCGAdataset，https:∥tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）数据库中关于肺腺癌的RNA-seq数据，并分析病例信息，包括基因表达数据和随访信息，明确lncRNATMPO-AS1在癌组织及癌旁组织中是否差异表达及对生存的影响。
2.收集16对ⅠA-ⅢB分期的LUAD术后肿瘤标本及相应癌旁正常组织，并用RT-qPCR技术检测分别组织标本中lncRNA TMPO-AS1的表达水平并分析不同的表达水平与患者临床病理特征之间的相关性。
3.运用RT-qPCR技术检测LUAD细胞株（A549、H1299、H1975、H226、PC9和SPC-A1）和正常人支气管上皮细胞系16HBE中LncRNATPO-AS1的表达量的区别。
结果：
1.评估了TCGA中肺腺癌标本及癌旁组织中LncRNA TMPO-AS1的表达，与癌旁组织相比，肺腺癌组织中的LncRNA TMPO-AS1明显上调（P＜0.05)。关于生存曲线，高LncRNATMPO-AS1表达的患者显示出较差的预后。
2.16例LUAD肿瘤组织标本中LncRNATMPO-AS1的水平，相对于成对的对照组织明显增高（P＜0.05)。在临床病理学方面，LncRNA TMPO-AS1表达水平与肿瘤TNM分期、淋巴结转移有关（P＜0.05)，与性别、年龄、吸烟史无关（P＞0.05)。
3.与组织水平一致，6种肺腺癌细胞的LncRNATMPO-AS1表达水平明显高于16HBE细胞（P＜0.05)。
第二部分 LncRNA TMPO-AS1对肺腺癌细胞功能的影响及体内实验
方法：
1.通过pcDNA3.1-TMPO-AS1质粒介导肺腺癌细胞系（A549和H1299）中ncRNA TMPO-AS1的过表达。
2.两个特异siRNA（称为siTMPO-AS1-1和2）转染肺腺癌细胞系A549和H1299，沉默内源性lncRNA TMPO-AS1表达。
3.CCK8实验、克隆形成实验、Transwell实验、划痕实验检测lncRNA TMPO-AS1过表达对肺腺癌细胞增殖、侵袭、迁移的影响。
4.CCK8实验、克隆形成实验、Transwell实验、划痕实验、流式细胞术检测沉默lncRNATMPO-AS1对肺腺癌细胞增殖、侵袭、迁移、细胞周期和凋亡的影响。
5.构建TMPO-AS1沉默的异种移植小鼠模型，探讨降低TMPO-AS1表达对成瘤的影响；westernblot检测沉默TMPO-AS1对凋亡相关蛋白的影响（Bax、PARP和c-PARP、caspase-3和c-caspase-3、Bcl-2）；免疫组织化学分析检测沉默TMPO-AS1对Ki-67、TUNEL、CD34表达的影响。
结果：
1.siTMPO-AS1-1和2分别转染肺腺癌细胞系A549和H1299，RT-qPCR结果示，与对照组相比，四组细胞中的TMPO-AS1表达水平均下调(P＜0.05)。
2.CCK8分析表明TMPO-AS1的上调促进了肺腺癌细胞系A549和H1299的增殖(P＜0.05)。克隆形成实验中，TMPO-AS1过表达中的克隆数量超过表达组明显高于对照组(P＜0.05)。另外，Transwell实验和划痕实验显示TMPO-AS1表达的增加促进了A549和H1299细胞的侵袭和迁移性。总之，这些结果提示，TMPO-AS1的过度表达会增加肺腺癌细胞的致瘤性。
3.CCK8分析表明，TMPO-AS1的沉默显著抑制了肺腺癌细胞生长。克隆形成分析证实TMPO-AS1的下调显著抑制了LUAD细胞的生长。细胞周期分布分析表明沉默TMPO-AS1显著降低了S相细胞(P＜0.05)并增加了G0/G1相细胞的百分比(P＜0.05)，提示TMPO-AS1的下调导致A549和H1299细胞G0/G1到S期的阻滞。流式细胞术显示siTMPO-AS1s组与对照组相比早期凋亡细胞比例显著增加(P＜0.05)，表明TMPO-AS1的下调诱导LUAD细胞凋亡。同时，Transwell实验和划痕实验显示TMPO-AS1下调抑制了A549和H1299细胞的侵袭和迁移性。
4.我们建立了TMPO-AS1敲低的异种移植小鼠模型，沉默TMPO-AS1显著降低了肿瘤的生长，sh-TMPO-AS1小鼠的肿瘤形成比对照组小（P＜0.05)）。此外，sh-TMPO-AS1组的肿瘤重量比对照组低（P＜0.05)）。此外，westernblot结果还显示了在TMPO-AS1基因敲除组中，Bax的表达，PARP和caspase-3的降解产物产物显著增加，而Bcl-2的表达水平显著降低。此外，免疫组织化学分析显示，与对照组肿瘤相比，实验组中Ki-67阳性细胞的数量和CD34染色明显减少（P＜0.05)，另外，TUNEL阳性细胞显著增加（P＜0.05)。
第三部分 LncRNATMPO-AS1在肺腺癌中的机制探索
方法：
1.通过FISH检测确定lncRNA TMPO-AS1在肺腺癌细胞A549和H1299细胞中的定位。
2.通过生物信息学分析查找可能与lncRNA TMPO-AS1结合的miRNA，RT-qPCR分析对lncRNA TMPO-AS1影响最大的miRNA，并进一步评估两者之间的潜在关系。
3.用miR-383-5p mimics及TMPO-AS1表达载体共转染A549和H1299细胞，研究miR-383-5p对TMPO-AS1介导的细胞功能学的影响。
4.通过双荧光素酶实验和RIP实验进行靶向性检测验证。
结果：
1.FISH实验表明lncRNATMPO-AS1在肺腺癌细胞的细胞质中。
2.生物信息学分析和RT-qPCR检测表明，miR-383-5p直接或间接地负调控lncRNATMPO-AS1。
3.A549和H1299细胞共转染了miR-383-5p mimics及TMPO-AS1表达载体，CCK8实验表明miR-383-5p可以部分抵消TMPO-AS1诱导的增殖；Transwell实验表明，miR-383-5p部分逆转了TMPO-AS1促进细胞侵袭的能力。
4.双荧光素酶实验和RIP实验证实lncRNA TMPO-AS1直接靶向结合于miR-383-5p。
结论：
1.LncRNA TMPO-AS1在肺腺癌组织及细胞中异常高表达，其表达水平与肿瘤TNM分期、淋巴结转移、生存期有关。
2.TMPO-AS1在肺腺癌增殖、迁移、侵袭、细胞周期及凋亡过程中具有促癌lncRNA的作用。
3.LncRNATMPO-AS1定位于肺腺癌细胞的细胞质；miR-383-5p直接靶向结合于TMPO-AS1，介导对其的负调控作用，为肺腺癌的靶向治疗提供了新的方向。
长非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNAs）是新近发现的一类非编码RNA（noncoding RNA,ncRNA）转录本，其长度约大于200个核苷酸。LncRNAs参与多种生物学过程，包括转录或转录后、表观遗传改变和mRNA处理。LncRNAs的失调与肿瘤发生、发展、转移、预后密切相关，可作为多种人类癌症的诊断或预后标志物或者靶向药物的重要靶点。
LncRNATMPO反义RNA1（TMPO antisense RNA1,TMPO-AS1）基因位于12号染色体，在人类疾病中很少报道。既往研究表明TMPO-AS1在包括肺癌在内的部分肿瘤中表达异常，并可促进肿瘤增殖。然而，TMPO-AS1在肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）中的具体作用及其分子机制尚不清楚。因此，我们的研究主要集中于TMPO-AS1在LUAD中的功能作用和其潜在作用机制。
本实验研究分为以下三个部分：第一部分肺腺癌中LncRNA TMPO-AS1的表达及意义；第二部分LncRNA TMPO-AS1对肺腺癌细胞功能的影响及体内实验；第三部分LncRNATMPO-AS1在肺腺癌中的机制探索。
第一部分 肺腺癌中LncRNATMPO-AS1的表达及意义
方法：
1.下载癌症基因组图谱计划（TCGAdataset，https:∥tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）数据库中关于肺腺癌的RNA-seq数据，并分析病例信息，包括基因表达数据和随访信息，明确lncRNATMPO-AS1在癌组织及癌旁组织中是否差异表达及对生存的影响。
2.收集16对ⅠA-ⅢB分期的LUAD术后肿瘤标本及相应癌旁正常组织，并用RT-qPCR技术检测分别组织标本中lncRNA TMPO-AS1的表达水平并分析不同的表达水平与患者临床病理特征之间的相关性。
3.运用RT-qPCR技术检测LUAD细胞株（A549、H1299、H1975、H226、PC9和SPC-A1）和正常人支气管上皮细胞系16HBE中LncRNATPO-AS1的表达量的区别。
结果：
1.评估了TCGA中肺腺癌标本及癌旁组织中LncRNA TMPO-AS1的表达，与癌旁组织相比，肺腺癌组织中的LncRNA TMPO-AS1明显上调（P＜0.05)。关于生存曲线，高LncRNATMPO-AS1表达的患者显示出较差的预后。
2.16例LUAD肿瘤组织标本中LncRNATMPO-AS1的水平，相对于成对的对照组织明显增高（P＜0.05)。在临床病理学方面，LncRNA TMPO-AS1表达水平与肿瘤TNM分期、淋巴结转移有关（P＜0.05)，与性别、年龄、吸烟史无关（P＞0.05)。
3.与组织水平一致，6种肺腺癌细胞的LncRNATMPO-AS1表达水平明显高于16HBE细胞（P＜0.05)。
第二部分 LncRNA TMPO-AS1对肺腺癌细胞功能的影响及体内实验
方法：
1.通过pcDNA3.1-TMPO-AS1质粒介导肺腺癌细胞系（A549和H1299）中ncRNA TMPO-AS1的过表达。
2.两个特异siRNA（称为siTMPO-AS1-1和2）转染肺腺癌细胞系A549和H1299，沉默内源性lncRNA TMPO-AS1表达。
3.CCK8实验、克隆形成实验、Transwell实验、划痕实验检测lncRNA TMPO-AS1过表达对肺腺癌细胞增殖、侵袭、迁移的影响。
4.CCK8实验、克隆形成实验、Transwell实验、划痕实验、流式细胞术检测沉默lncRNATMPO-AS1对肺腺癌细胞增殖、侵袭、迁移、细胞周期和凋亡的影响。
5.构建TMPO-AS1沉默的异种移植小鼠模型，探讨降低TMPO-AS1表达对成瘤的影响；westernblot检测沉默TMPO-AS1对凋亡相关蛋白的影响（Bax、PARP和c-PARP、caspase-3和c-caspase-3、Bcl-2）；免疫组织化学分析检测沉默TMPO-AS1对Ki-67、TUNEL、CD34表达的影响。
结果：
1.siTMPO-AS1-1和2分别转染肺腺癌细胞系A549和H1299，RT-qPCR结果示，与对照组相比，四组细胞中的TMPO-AS1表达水平均下调(P＜0.05)。
2.CCK8分析表明TMPO-AS1的上调促进了肺腺癌细胞系A549和H1299的增殖(P＜0.05)。克隆形成实验中，TMPO-AS1过表达中的克隆数量超过表达组明显高于对照组(P＜0.05)。另外，Transwell实验和划痕实验显示TMPO-AS1表达的增加促进了A549和H1299细胞的侵袭和迁移性。总之，这些结果提示，TMPO-AS1的过度表达会增加肺腺癌细胞的致瘤性。
3.CCK8分析表明，TMPO-AS1的沉默显著抑制了肺腺癌细胞生长。克隆形成分析证实TMPO-AS1的下调显著抑制了LUAD细胞的生长。细胞周期分布分析表明沉默TMPO-AS1显著降低了S相细胞(P＜0.05)并增加了G0/G1相细胞的百分比(P＜0.05)，提示TMPO-AS1的下调导致A549和H1299细胞G0/G1到S期的阻滞。流式细胞术显示siTMPO-AS1s组与对照组相比早期凋亡细胞比例显著增加(P＜0.05)，表明TMPO-AS1的下调诱导LUAD细胞凋亡。同时，Transwell实验和划痕实验显示TMPO-AS1下调抑制了A549和H1299细胞的侵袭和迁移性。
4.我们建立了TMPO-AS1敲低的异种移植小鼠模型，沉默TMPO-AS1显著降低了肿瘤的生长，sh-TMPO-AS1小鼠的肿瘤形成比对照组小（P＜0.05)）。此外，sh-TMPO-AS1组的肿瘤重量比对照组低（P＜0.05)）。此外，westernblot结果还显示了在TMPO-AS1基因敲除组中，Bax的表达，PARP和caspase-3的降解产物产物显著增加，而Bcl-2的表达水平显著降低。此外，免疫组织化学分析显示，与对照组肿瘤相比，实验组中Ki-67阳性细胞的数量和CD34染色明显减少（P＜0.05)，另外，TUNEL阳性细胞显著增加（P＜0.05)。
第三部分 LncRNATMPO-AS1在肺腺癌中的机制探索
方法：
1.通过FISH检测确定lncRNA TMPO-AS1在肺腺癌细胞A549和H1299细胞中的定位。
2.通过生物信息学分析查找可能与lncRNA TMPO-AS1结合的miRNA，RT-qPCR分析对lncRNA TMPO-AS1影响最大的miRNA，并进一步评估两者之间的潜在关系。
3.用miR-383-5p mimics及TMPO-AS1表达载体共转染A549和H1299细胞，研究miR-383-5p对TMPO-AS1介导的细胞功能学的影响。
4.通过双荧光素酶实验和RIP实验进行靶向性检测验证。
结果：
1.FISH实验表明lncRNATMPO-AS1在肺腺癌细胞的细胞质中。
2.生物信息学分析和RT-qPCR检测表明，miR-383-5p直接或间接地负调控lncRNATMPO-AS1。
3.A549和H1299细胞共转染了miR-383-5p mimics及TMPO-AS1表达载体，CCK8实验表明miR-383-5p可以部分抵消TMPO-AS1诱导的增殖；Transwell实验表明，miR-383-5p部分逆转了TMPO-AS1促进细胞侵袭的能力。
4.双荧光素酶实验和RIP实验证实lncRNA TMPO-AS1直接靶向结合于miR-383-5p。
结论：
1.LncRNA TMPO-AS1在肺腺癌组织及细胞中异常高表达，其表达水平与肿瘤TNM分期、淋巴结转移、生存期有关。
2.TMPO-AS1在肺腺癌增殖、迁移、侵袭、细胞周期及凋亡过程中具有促癌lncRNA的作用。
3.LncRNATMPO-AS1定位于肺腺癌细胞的细胞质；miR-383-5p直接靶向结合于TMPO-AS1，介导对其的负调控作用，为肺腺癌的靶向治疗提供了新的方向。