自本世纪二十年代自由基学说创立以来,对于自由基损伤的研究就不断深入。大量研究表明,有机体的多种疾病都与自由基对机体的氧化损伤有关,自由基对生命与健康的影响和重要性已毋庸置疑,因此寻找有效的抗氧化剂就显得十分重要。目前,由于合成抗氧化剂如二丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)等多数技术复杂,成本较高,且有较大的毒性甚至致癌作用,使人们对合成抗氧化剂产生疑虑和排斥心理,临床应用有较大的局限性,而天然抗氧化剂安全,低毒,符合新世纪人们对健康的需求,因此,从资源丰富的天然药物中寻找高效、低毒、价廉的抗氧化剂已成为该领域研究的一个重要方向,其抗氧化作用机制的研究,对进一步天然抗氧化药物的研究开发具有重要意义。第一部分葡萄籽原花青素抗心肌细胞氧化损伤作用及机制原花青素(Proanthocyanidins或Procyanidins,简称PC)是植物中广泛存在的一大类多酚化合物的总称。起初统归于缩合鞣质或黄烷醇类。随着分离鉴定技术的提高和对此类物质的深入研究与深刻认识,现已成为独树一帜的一大类物质并称之为原花青素。40多年来人们对从众多不同植物中提取出的PC进行了大量研究,作为PC的理想来源,葡萄籽原花青素提取物(Grape seed proanthocyanidinsextract,GSP)得到了最为深入和广泛的关注。GSP是由不同数量的儿茶素或表儿茶素聚合而成。最简单的原花青素是儿茶素与表儿茶素形成的二聚体,此外还有三聚体、四聚体等直至十聚体。按聚合度的大小,通常将二～四聚体称为低聚体,将五聚体上的称为高聚体。GSP以B型为主,二聚体中,因两个单体的构象或键合位置的不同,可有多种异构体,已分离鉴定的8种结构形式分别命名为B1～B8。GSP具有多种重要生物活性,成为近年研究的热点。心血管疾病是世界范围内导致人类死亡的一个主要病因。它包括其自身的一套病理现象,主要有动脉硬化,高血压,充血性心脏损伤,心肌病,冠心病,心肌肥大,心律不齐,心室纤维颤动,心动过速,心肌梗塞等。大量动物实验以及人体实验表明氧化压力在心脏损伤的发病机理中发挥重要作用。当自由基产生和细胞内抗氧化防御的平衡被过多的自由基打破时,将会产生氧化压力从而诱导细胞损伤。自由基和氧化压力可以诱导细胞凋亡,主要是通过脂质过氧化反应以及形成脂质过氧化氢物。自由基清除物和抗氧化剂对多种心血管疾病具有保护作用。第一节葡萄籽原花青素通过诱导细胞内的抗氧化酶保护心肌细胞凋亡大量研究表明葡萄籽提取物(Grape seed extract,GSE)对多种心脏疾病有保护作用。GSE的心血管保护作用主要归功于其抗氧化的特性。一系列研究表明多酚是GSE抗氧化功能的主要成分。本研究探讨从GSE中提取分离的两种主要的多酚化合物(儿茶素和原花青素B4)能否增加心肌细胞内的抗氧化酶,且这种增强的细胞内抗氧化防御能否保护氧化心肌细胞损伤,取得了以下结果:1.儿茶素或原花青素B4可以显著诱导心肌细胞H9C2内的抗氧化酶,该作用成浓度依赖的趋势。2.儿茶素或原花青素B4预处理可以显著降低黄嘌呤氧化酶/黄嘌呤诱导的H9C2细胞内ROS积聚和细胞凋亡。以上研究结果表明葡萄籽原花青素可以通过诱导细胞内的抗氧化酶保护心肌细胞凋亡。这个可能是GSE保护多种形式心血管疾病的一个重要机制。第二节葡萄籽原花青素对阿霉素诱导的心肌细胞毒性的保护作用及机制阿霉素是一种高效的抗癌药,但其严重的心肌损伤的副作用限制了其临床应用。据报道表明GSE对阿霉素诱导的心肌细胞毒性有保护作用。本研究探讨从GSE中提取分离的两种主要的多酚化合物(儿茶素和原花青素B4)对阿霉素诱导的心肌细胞损伤的保护作用以及其相关机制,取得了以下结果:1.儿茶素和原花青素B4可以减少阿霉素诱导的心肌细胞内ROS的积聚。2.儿茶素和原花青素B4可以减少阿霉素诱导的心肌细胞凋亡并防止DNA断裂。3.儿茶素和原花青素B4可以调节心肌细胞内促凋亡蛋白Bax-α和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。4.儿茶素和原花青素B4可以抑制心肌细胞内的凋亡信号通路。由于葡萄籽原花青素是GSE的主要活性成分,以上研究结果可能是GSE对阿霉素诱导的心脏毒性保护作用的重要机制,因此,为临床应用GSE和葡萄籽原花青素治疗由阿霉素引起的心脏毒性副作用提供了理论依据。第二部分冬凌草甲素对砷诱导的细胞毒性和细胞凋亡的保护作用及机制砷(Arsenic,As)是环境中一种主要的污染物,它存在与泥土和矿石中最终进入地下水系统,从而污染饮用水资源,含砷的地下水对人类的健康是一个巨大的威胁。在不同的地区地下水砷污染的浓度有很大的差别,在东亚地区砷污染的浓度最高,其中包括孟加拉国,印度和中国。国际健康组织和地方政府为降低由饮用水砷污染引起的损失做了很多努力,然而,大量人群还是暴露在砷污染的危险中,承受着砷污染可能带来的副作用,例如高血压,动脉硬化,糖尿以及多种癌症。最好的方法当然是降低砷的摄入,然而这并不是很现实,因为很多人无法选择只有依靠含有砷污染的饮用水和粮食生活,因为那是他们唯一的食物来源。所以另一种重要的解决方法就是通过调节机体的防御机制来抵抗砷的有害作用。转录因子Nrf2是细胞内抗氧化应答和外来物质代谢的一个关键调控子,它通过上调ARE相关的基因,包括那些编码细胞内抗氧化剂,二相酶和转录子的基因来决定细胞的命运。Nrf2依赖的蛋白表达对维持细胞内氧化还原动态平衡起到关键作用,因此,天然化合物或合成化合物通过激活Nrf2途径可以保护细胞有毒性物质或致癌物引起的损伤,用天然化合物或合成化合物来激活Nrf2依赖的适应性应答从而抵抗环境中的毒性是癌症预防的一个重要策略。近期研究表明,激活Nrf2信号通路对砷诱导的细胞毒性有保护作用,应用天然Nrf2激活剂对抗砷的毒性具有重要意义。冬凌草甲素(Oridonin)是从唇形科香茶菜属植物中分离出的一种贝壳杉烯二萜类天然化合物,主要植物来源有:香茶菜、显脉叶香茶菜、毛叶香茶菜、道孚香茶菜、冬凌草、延命草等。目前关于冬凌草甲素的研究主要集中在其抗肿瘤的作用,其抗癌活性被认为主要是依赖其抑制肿瘤细胞增长,减少血管生成以及增加肿瘤细胞凋亡。本研究探讨了冬凌草甲素对砷诱导的细胞毒性和凋亡的保护作用,我们证明了冬凌草甲素是个新的Nrf2激活剂并阐明了Nrf2途径被激活的机制。进一步,我们证明了用针对Nrf2的天然化合物作为一种治疗手段的可行性,从而保护人类免于日常生活中的各种环境因素的伤害。第一节冬凌草甲素保护由砷诱导的UROtsa细胞毒性和细胞凋亡为了明确冬凌草甲素对砷诱导的细胞毒性的保护作用,我们采用了UROtsa细胞(膀胱尿路上皮细胞)模型,该模型为研究砷毒性的经典模型。取得了以下结果:1.1.4μM冬凌草甲素可以显著提高细胞内谷胱甘肽水平。2.30μM亚砷酸钠[As(Ⅲ)]作用24h可以显著提高细胞内的ROS水平,用一系列不同浓度的冬凌草甲素可以显著地降低ROS水平,5.6μM冬凌草甲素的作用最为明显。3.用Annexin V-FITC流式细胞检测法和Hoechst染色法均表明1.4μM冬凌草甲素可以降低由砷诱导的细胞凋亡。4.冬凌草甲素可以诱导UROtsa细胞中的Nrf2蛋白,在浓度为1.4μM到14μM间呈现剂量依赖关系,当剂量高于14μM,会对细胞产生毒性,对Nrf2的诱导降低。5.用MTT法和克隆形成检测法均表明1.4μM冬凌草甲素预处理UROtsa24h可以显著提高用砷处理48h的细胞的存活率,用Nrf2-siRNA转染UROtsa细胞后,MTT结果表明冬凌草甲素失去了其对砷诱导的细胞毒性的保护作用。以上研究结果表明低剂量的冬凌草甲素可以通过提高细胞内的氧化还原能力,抑制由砷诱导的氧化压力,提高细胞的存活率以及降低细胞凋亡从而抵抗砷诱导的细胞损伤,且冬凌草甲素的保护作用需要通过激活Nrf2途径。第二节冬凌草甲素是一个Nrf2转录因子激活剂研究表明ARE-荧光素酶报告基因的活性与Nrf2的蛋白表达水平联系紧密,因此检测冬凌草甲素对ARE-荧光素酶报告基因的活性的影响,可以反应其对Nrf2的作用。1.用高通量荧光素酶报告系统检测,结果显示冬凌草甲素剂量依赖性的提高荧光素酶的活性。2.为了进一步确证高通量荧光素酶报告系统的检测结果,采用双荧光素酶报告系统检测,结果也显示冬凌草甲素剂量依赖性的提高萤火虫荧光素酶的活性。以上研究结果证明冬凌草甲素是一个Nrf2转录因子激活剂。第三节冬凌草甲素通过上调Nrf2蛋白水平激活ARE依赖的抗氧化应答本章围绕冬凌草甲素对Nrf2蛋白水平和对相关基因mRNA水平的作用取得了以下结果:1.将双荧光素酶实验的细胞裂解液用于Nrf2,Keapl andβ-actin的免疫印迹检测,结果表明,冬凌草甲素素可以剂量依赖性的提高Nrf2的蛋白水平,14μM时作用最强。2.检测高浓度冬凌草甲素作用是对Nrf2蛋白水平的影响,结果表明当冬凌草甲素浓度高于28μM时剂量依赖性地降低Nrf2蛋白水平,且Keap1和β-actin的表达没有明显变化。3.用real time RT-PCR检测了冬凌草甲素处理后Nrf2以及其下游基因NQO1和HO-1 mRNA的表达水平。结果表明Nrf2 mRNA水平有较弱的提高,呈剂量依赖关系。NQO1和HO-1的mRNA水平都有显著的提高,且呈剂量关系。以上研究结果表明冬凌草甲素主要通过上调Nrf2的蛋白水平来诱导Nrf2信号通路。第四节冬凌草甲素阻断Nrf2泛素化并增强Keap1泛素化tBHQ通过干扰keap-1依赖的泛素结合过程从而提高Nrf2蛋白水平,因此,我们也检测了冬凌草甲素调节Nrf2泛素化的能力,取得了以下结果:1.冬凌草甲素抑制MDA-MB-231细胞和UROtsa细胞中Nrf2的泛素化。2.冬凌草甲素增加MDA-MB-231细胞和UROtsa细胞中keap1的泛素化。3.冬凌草甲素延长MDA-MB-231细胞中内源性Nrf2蛋白的半衰期,从19分钟到51分钟;冬凌草甲素延长UROtsa细胞中内源性Nrf2蛋白的半衰期,从10分钟到16分钟。以上研究结果表明冬凌草甲素诱导泛素化由Nrf2转移到Keap1,它通过抑制Nrf2的泛素化和降解使Nrf2的蛋白水平提高,从而激活Nrf2依赖的抗氧化应答。