前言人类乳头瘤病毒（human papilloma virus,HPV）是乳多空病毒科多瘤病毒亚科的一组嗜黏膜和皮肤上皮的双连环状DNA病毒,其感染靶器官主要为上皮组织,显示高度的宿主特异性,对人体特异部位的上皮细胞具亲和力。它可引起寻常疣、扁平疣、跖疣等非生殖道疾病,也可引起尖锐湿疣等多种生殖道疾病。现已鉴定出120余种HPV基因型。现阶段临床治疗上主要采用理化（如冷冻、电灼术、高热激光、化学腐蚀）、细胞毒类药物等创伤性方法治疗病毒疣。这些手段的基本原理是清除HPV感染的皮肤组织达到治疗目的。但这些方法引起的痛苦度高,治疗后需要较长时间的创伤恢复期（多有瘢痕形成）,不易被患者接受。热疗是一种利用物理方法将组织器官或全身加热的治疗手段,目前热疗在临床上的应用分为三类:局部热疗（包括浅表加热、腔内热疗和插植热疗）,区域热疗（包括深部肿瘤加热以及各种热灌注技术）和全身热疗。其中局部高温（localhyperthermia）治疗皮肤疾病已经有几十年的历史。在过去的几十年内,局部温热曾用于治疗动物和人类多种表浅和深层的良恶性肿瘤。有报道加热温度在39℃—45℃范围的温热治疗,在脏器肿瘤及感染性疾病中发挥积极的作用。我国传统医学有成功利用灸烤疗法治疗皮肤疣的经验。国外有一些临床报告,初步观察到温热对寻常疣、跖疣有较好的治疗效果,且温热治疗条件温和,未见有严重急慢性损伤的报道。虽然局部热疗在病毒疣的治疗中具有较好的疗效,但目前尚无关于其治疗作用机制的报道。Peter Stem等认为温热治疗疣的主要原理是病灶组织与正常组织相比对温热更敏感,热损伤后更不易恢复;作者同时认为温热对机体免疫功能的影响也可能是导致疣消退的原因之一。Pfau等也推测可能是温热引起病变组织坏死,物理性地去除了HPV病毒,如同其它破坏性物理治疗手段一样;也可能是由于温热直接引起病毒破坏所致或者是由于炎症反应导致病毒的去除。Gatto等发现43℃温热条件下角质形成细胞的形态发生了部分改变,包括:胞浆萎缩,胞间隙增加和细胞核膨胀,但生物活性不受影响;在44℃或更高的温度下,角质形成细胞死亡率升高。因此,我们推测温热治疗病毒疣可能的机制为:1、促进HPV感染角质形成细胞的凋亡;2、促进局部免疫反应以清除病毒;3、对HPV病毒本身产生影响。因HPV不能在体外培养,我们采用尖锐湿疣组织标本作为病毒载体,利用温热治疗仪进行不同温度照射,采用器官培养的模式,模拟体内环境,观察不同温度处理对HPV感染皮肤的影响。尖锐湿疣（condyloma acuminatum,CA）是由HPV感染引起的一种常见的性传播疾病,发病率呈逐年升高的趋势。该病传染性大,对社会和家庭危害极大,严重影响患者身心健康。临床上CA治疗困难,并存在治疗后高复发率的难题,这对控制该病的传播及流行造成很大困难,因而越来越受到人们的重视。李晓东等研究表明温热处理后尖锐湿疣皮损内朗格汉斯细胞数目明显减少、密度降低、胞体缩小;随温度逐渐升高,LC从表皮中游走的数量增加,且成熟LC逐渐增多,LC表面特异性趋化因子受体CCR6表达逐渐下降,而CCR7的表达逐渐增加。说明温热能够促进LC成熟,促进LC的迁移和增强抗原提呈能力,LC通过真皮向局部淋巴结迁移,在局部细胞免疫应答中发挥作用（待发表）。在表皮内,LC与角质形成细胞密切接触,并有功能的联系。角质形成细胞合成分泌的促炎症因子对LC的功能活性有影响。因此,本研究拟开展以下两个方面工作:1)探讨温热是否能促进HPV感染角质形成细胞发生凋亡,以及可能的凋亡途径;2)检测温热能否影响角质形成细胞合成分泌促炎症细胞因子,以了解角质形成细胞在抗HPV免疫应答中的作用。材料与方法一、标本处理经患者知情同意后,取12例经临床及病理确诊的尖锐湿疣患者的疣体;其中男4例,皮损取自肛周;女8例,皮损均取自外阴。年龄22～48岁,平均32.6岁;病程1～6个月,平均2.1个月。每份标本等分成4份:一份直接冻存:另3份真皮侧向下,使组织浸于RPMI 1640培养液中。利用温热治疗仪（远红外光源,具有温度反馈系统,输出温度误差为±0.1℃）将3份组织分别加热至37℃,42℃,45℃,持续30分钟;然后将温热处理后的组织放入37℃,5%CO₂培养箱继续培养12h,-70℃冻存备用。4例正常皮肤取自整形术后。二、HPV分型采用TaKaRa公司的Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 DNA纯化试剂盒提取DNA,采用HPV6/11型特异性引物进行PCR扩增,采用1.5%琼脂糖凝胶电泳,紫外凝胶成像系统拍照记录结果。三、原位检测细胞凋亡冰冻切片经4%多聚甲醛固定后,采用原位缺口末端标记检测（TUNEL）法检测角质形成细胞的凋亡情况,选5个高倍视野计数凋亡细胞数,取其平均值,并进行各组间比较。四、凋亡相关基因mRNA的检测采用荧光实时定量PCR方法检测DR4、DR5、Fas、Bax、Bcl-2mRNA的表达。按TRnzol试剂说明书提取总RNA;用TIANScript M-MLV试剂盒反转录合成cDNA;SYBR-Green法进行荧光实时定量PCR扩增,采用双标准曲线法进行相对定量分析。反应条件:95℃2分钟,（95℃15秒,56℃30秒,68℃40秒）40个循环。五、凋亡相关蛋白表达的检测采用免疫组化SP法检测Fas、Bax、Bcl-2蛋白的表达。六、细胞因子mRNA的表达采用荧光实时定量PCR方法检测CCL-20、TNF-α、IL-1αmRNA的表达。方法同四。七、统计学分析凋亡细胞数、凋亡相关基因表达及细胞因子mRNA表达采用方差分析和独立样本t检验。凋亡细胞数与凋亡基因mRNA表达相关性采用双变量相关分析,凋亡相关蛋白免疫组化结果采用Mann Whitney Test分析。P＜0.05被认为具有统计学意义。结果一、角质形成细胞凋亡凋亡细胞表现为胞核固缩状,呈棕褐色着色。尖锐湿疣未处理组可见少量凋亡细胞位于颗粒层及棘层上部,明显高于正常皮肤;37℃组凋亡细胞有所增多,但与未处理组比较无统计学意义;42℃及45℃照射组角质形成细胞凋亡显著增多,甚至分布于表皮全层,凋亡细胞数分别为58.03±12.45、66.21±8.82,与未处理组及37℃组比较有显著性差异（p＜0.01）,结果表明尖锐湿疣角质形成细胞的凋亡随温度升高而增加。不同温度处理的CA组织细胞凋亡细胞数与感染的HPV型别无关。正常皮肤温热处理后,角质形成细胞的凋亡细胞随温度升高明显增加,呈温度依赖性。二、凋亡相关基因的表达尖锐湿疣皮损内DR4、DR5、Fas、Bax、Bcl-2 mRNA表达均高于正常组织。温热处理后DR4、DR5、Fas、Bax mRNA随温度升高表达明显升高,Bcl-2的表达随温度升高而下降。正常皮肤组织温热处理后,随温度升高Fas、Bax表达明显升高,而DR4、DR5、Bcl-2未见明显变化。CA凋亡细胞数与DR4、DR5、Fas、Bax表达呈正相关,与Bcl-2表达呈负相关。正常皮肤角质形成细胞凋亡与Fas、Bax表达呈显著正相关。三、凋亡相关蛋白的表达尖锐湿疣皮损内Fas、Bax、Bcl-2蛋白表达高于正常组织。温热处理后Fas、Bax蛋白随温度升高表达明显增加,而Bcl-2蛋白温热处理后未见明显表达。正常组织中未见明显Fas、Bcl-2蛋白表达,Bax蛋白少量阳性表达,随温度升高Fas、Bax蛋白表达明显升高,而Bcl-2未见明显表达。四、细胞因子的表达尖锐湿疣皮损内CCL-20、TNF-α、IL-1αmRNA的表达高于正常皮肤,温热处理后CCL-20、IL-1αmRNA表达下降,而TNF-α表达未见明显变化。正常皮肤45℃温热处理后CCL-20、IL-1αmRNA表达升高,TNF-α表达无明显变化。结论1、局部温热可促进尖锐湿疣及正常皮肤角质形成细胞的凋亡,尤其是温度达42℃以上,诱导细胞凋亡是温热发挥作用的机制之一。2、尖锐湿疣皮损内DR4、DR5、Fas、Bcl-2、Bax mRNA的表达及Fas、Bcl-2、Bax蛋白的表达高于正常组织。温热可通过上调凋亡促进基因DR4、DR5、Fas、Bax的表达,下调凋亡抑制基因Bcl-2的表达诱导尖锐湿疣角质形成细胞的凋亡。在正常皮肤温热可通过促进Fas、Bax的表达诱导细胞凋亡。3、尖锐湿疣皮损内CCL-20、TNF-α、IL-1αmRNA水平高于正常皮肤组织。温热处理后尖锐湿疣皮损内CCL-20、IL-1αmRNA水平下降。正常皮肤45℃温热处理后CCL-20、IL-1αmRNA表达升高。温热对TNF-α表达无明显影响。