目的:损伤神经修复与功能重建是当今生物医学领域研究的热点,临床迫切需要开发具有促神经元生长及神经保护作用的新药。本实验室采用盐析技术从传统中药牛膝中提取得到牛膝多肽混合物(Achyranthes bidentata polypeptides,ABPP),具有较好的促神经损伤修复及神经保护作用。本研究采用反相高效液相色谱和质谱联用技术,在活性指导下对ABPP进行逐级分离,得到牛膝活性肽单体,进行结构表征,并探讨其促神经生长和抗脑缺血损伤的生物学作用。方法:第一部分:牛膝活性肽的分离鉴定1、采用盐析法制备ABPP;采用C18反相色谱梯度分离ABPP;通过体外促神经元生长及神经元氧糖剥夺损伤模型,筛选ABPP中的活性组分。2、采用生物C18反相色谱结合Q-TOF质谱对筛选得到的活性组分进行分离鉴定;通过体外促神经元生长模型,筛选其中的单体牛膝活性肽,采用Edman降解和核磁共振技术对牛膝活性肽进行氨基酸序列和二级结构分析。第二部分:牛膝活性肽促神经元生长的作用1、采用体外培养的胎鼠海马神经元生长模型,通过实时细胞分析系统检测不同浓度(4ng/ml,20ng/ml,100ng/ml)牛膝活性肽对海马神经元生长指数的影响;通过免疫细胞化学染色观察牛膝活性肽对海马神经元生长锥表面积、丝状伪足长度、轴突长度、突起数目、分支数目、突触密度的影响;通过活细胞工作站观察牛膝活性肽对海马神经元突起生长速度的影响;通过Western blot检测牛膝活性肽对突触后致密蛋白表达的影响。2、采用体外培养的胎鼠海马神经元生长模型,在培养体系中加入牛膝活性肽,于不同时间点(0h,0.25h,1h,4h,12h)提取总RNA,进行转录组测序,通过生物信息学技术分析牛膝活性肽参与调控海马神经元生长的核心基因。第三部分:牛膝活性肽对脑缺血再灌注损伤的保护作用1、采用体外培养的胎鼠皮层神经元氧糖剥夺模型,通过CCK-8试剂盒检测不同浓度(8 ng/ml,40 ng/ml,200 ng/ml)牛膝活性肽对神经元活力的影响;通过DCFH-DA荧光探针检测牛膝活性肽对神经元活性氧含量的影响;通过JC-1荧光探针检测牛膝活性肽对神经元线粒体膜电位的影响;通过Hoechst染色观察牛膝活性肽对神经元凋亡小体的影响;通过Western blot分析牛膝活性肽对神经元凋亡相关蛋白表达的影响。2、采用线栓法建立大鼠MCAO模型,通过TTC染色法观察不同剂量(0.1 mg/kg,0.5 mg/kg,1.0 mg/kg)牛膝活性肽对脑梗死体积的影响;通过黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法测定脑组织中SOD活力和MDA含量;通过尼氏染色观察牛膝活性肽对缺血半影区神经元完整性的影响;通过荧光右旋糖酐静脉灌注脑血管造影,观察牛膝活性肽对缺血半影区脑血管通畅率的影响;通过免疫组织化学染色,观察牛膝活性肽对脑血管内皮纤维蛋白和血小板沉积的影响,对多形核白细胞浸润的影响;通过荧光原位明胶酶谱法观察牛膝活性肽对脑缺血半影区基质金属蛋白酶活化的影响;通过Western blot检测牛膝活性肽对脑组织凋亡相关蛋白的影响;通过神经缺陷评分和水迷宫试验,观察牛膝活性肽对大鼠长期神经缺陷和学习记忆能力的影响。结果:第一部分:牛膝活性肽的分离鉴定1、通过C18反相色谱柱梯度分离ABPP,得到12个二级组分,体外活性筛选实验发现,其中第11个组分(按各二级组分出峰顺序,以英文字母排序,将其称作ABPPk)具有显著的促神经元生长和抗氧糖剥夺损伤的生物学作用(中国发明专利:201310108655.6)。2、通过生物C18反相色谱结合Q-TOF质谱,进一步分离ABPPk,得到2个单体肽,分别称之为ABPPk1和ABPPk2,通过体外细胞实验,确认其中的ABPPk2具有促神经元生长活性。采用Edman降解法测定ABPPk2的氨基酸序列为CXXXXXXCIPGXXXXCCXXVCVPIVTXXXXXXY,逐步衍生和核磁共振分析显示,其二级结构为3对二硫键形成的反向平行折叠结构。(鉴于发明专利尚未申报,故暂未列出一、二级结构,其中部分氨基酸序列用X代替)第二部分:牛膝活性肽促神经元生长的作用1、ABPPk2能显著促进海马神经元的生长,并可显著增加海马神经元突起生长锥面积和丝状伪足长度、突起长度和突起数目、突起分支数目、突触密度,并上调突触后致密蛋白的表达;明显加快海马神经元突起生长速度。2、海马神经元转录组测序及生物信息学分析结果显示,ABPPk2可显著上调转录因子、神经发生和神经元分化相关基因;通过WGCNA-GO分析得到13个核心基因 Satb2、Tmem2、Dlx1、Trim66、RGD1563615、Ctse、Rpap1、Ano1、Lhx8、Lgi1、Lrfn5、Ppp1r1b及Vax1;对其中一个核心基因Lhx8的表达进行验证,结果与芯片结果基本一致。第三部分:牛膝活性肽对脑缺血再灌注损伤的保护作用1、体外研究结果显示,ABPPk2能显著减轻氧糖剥夺诱导的神经元活力的下降,减少氧糖剥夺诱导的神经元活性氧产生,减轻氧糖剥夺诱导的神经元线粒体膜电位下降,有效抑制氧糖剥夺损伤诱导的神经元凋亡,明显抑制促凋亡蛋白Bax和Cleaved caspase 3的表达,促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,并减少线粒体Cytochrome C和AIF的释放。2、体内研究结果显示,ABPPk2能明显缩小脑梗死体积,降低脑组织中MDA含量,维持SOD的活力,有效维持缺血半影区神经元的完整性,明显改善缺血半影区的血管通畅率,显著减少血管内皮纤维蛋白和血小板沉积,减轻脑实质多形核白细胞浸润,显著抑制缺血半影区基质金属蛋白酶的活化,有效抑制细胞凋亡,抑制促凋亡蛋白Bax、Cleaved caspase 3的表达,促进抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x1的表达,能明显改善MCAO大鼠长期神经功能缺陷和学习记忆能力。结论:1、本研究从牛膝中分离得到具有促神经元生长和神经保护作用的单体牛膝活性肽 ABPPk2,其精确分子量为 3416.46 Da,氨基酸序列为CXXXXXXCIPGXXXXCCXXVCVPIVTXXXXXXY,其肽链通过 3 对二硫键形成反向平行折叠的二级结构。2、牛膝活性肽ABPPk2具有促海马神经元生长作用,此作用可能与其调控神经元转录因子、神经发生和神经元分化等相关基因的表达相关。3、牛膝活性肽ABPPk2对氧糖剥夺诱导的皮层神经元损伤及大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用。