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研究背景急性肺损伤(ALI)是一种严重威胁人类生命的疾病,至今还无特殊有效的治疗方法。中药名方凉膈散(LGS)在临床上可用于治疗ALI,但是其潜在的药理机制并不十分明确。本文重点研究LGS抑制内毒素(LPS)所致ALI的作用机制。研究目的探讨LGS抑制LPS所致ALI的作用机制,为凉膈散的临床运用提供实验数据支持。方法与结果1、采用噻唑蓝法(MTT)评价LGS对小鼠巨噬细胞系RAW264.7的细胞毒性作用。MTT实验的结果显示,50,100,200μg/ml的LGS基本没有细胞毒性(存活率>90%)。因此,选择该浓度的LGS用于后续实验研究。酶联免疫吸附法(ELISA)检测非毒剂量LGS对RAW264.7细胞的炎症模型中细胞炎症因子白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和炎症相关因子ROS表达的影响。结果显示,LGS以剂量依赖性的方式显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞的IL-6、TNF-α、IL-11β和炎症相关因子ROS的产生。综合运用蛋白印迹法(Western blotting)、免疫荧光及荧光素酶报告基因实验(Luciferase assay)检测LGS对LPS刺激的RAW264.7细胞中STAT3原型及其磷酸化的影响以及对STAT3转录活性的调控。Western blotting和免疫荧光实验结果显示,LGS抑制了 STAT3及其磷酸化水平的表达。Luciferase assay结果显示,LGS可以抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中STAT3的转录活性。运用荧光实时定量 PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)检测 LGS对microRNA-21(miR-21)及 STAT3 mRNA、IL-6 mRNA的影响。qPCR分析显示,LGS可上调RAW264.7细胞中miR-21的表达,且抑制STAT3 mRNA和IL-6 mRNA的表达。综合运用Western blotting、DSS交联实验及ELISA检测使用 miR-21 inhibitor 后,LGS 对 LPS 刺激的 RAW264.7 细胞中 STAT3、P-STAT3、STAT3二聚体表达及IL-6表达的影响。结果显示,miR-21 inhibitor抑制LGS对miR-21的上调作用,并且减弱LGS对LPS诱导的炎症因子释放、STAT3蛋白的磷酸化及STAT3二聚化的抑制作用。2、采用气管滴注LPS诱导ALI小鼠模型评价LGS在体内的抗炎作用。预先给予低(5 g·kg-1),中(10 g·kg-1),高(15 g·kg-1)剂量LGS,在第七天时,气管滴注LPS(3 mg.kg-1)诱导小鼠ALI模型,8小时后处死小鼠,取肺组织及肺泡灌洗液(BALF)。通过肺湿干重比率、H&E染色和ELISA检测LGS的抗炎活性。肺湿干重及H&E染色结果显示,LGS剂量依赖性地降低了LPS诱导的ALI小鼠肺组织的充血和水肿。ELISA检测显示,LGS能抑制炎症因子IL-6。运用Western blotting和qPCR检测LGS对小鼠肺组织中的STAT3、P-STAT3及miR-21的影响。Western blotting结果显示,LGS抑制了ALI小鼠肺组织中STAT3的表达及磷酸化。此外,qPCR分析显示,给予LGS后肺组织中miR-21的表达显著升高,与体外研究结果一致。结论本研究结果表明LGS具有抑制LPS诱导的ALI的作用。其作用机制可能是通过上调miR-21的表达,进而抑制STAT3信号通路,最终抑制炎症因子IL-6的释放。