研究背景与研究目的糖尿病肾病(DN)作为糖尿病的微血管并发症之一是导致终末期肾脏病(ESRD)的一个主要病因。许多致病因素造成DN的发生与发展。肾小球损伤,尤其是系膜细胞增生以及肾小球内高压是DN的主要病理特点,然而许多临床研究和实验室动物研究表明肾小管上皮细胞损伤与肾功能降低有密切关系,并作为评估DN预后的指标之一。因此探究肾小管上皮细胞损伤在DN发病机制中的作用并寻找可早期防治的药物是十分必要的。氧化应激是指自由基的产生和抗氧化物质抵御之间的不平衡,从而导致组织损伤。很多研究表明氧化应激在DN的发生和发展机制过程中有非常重要的作用。近年来,关于叉头框蛋白 O3a(FOX03a)在肾脏疾病发病机制中的作用受到广泛关注。FOX03a是叉头框蛋白(FOXO)家族中的一员,在老化,细胞代谢,胰岛素抵抗和抑制氧化应激方面发挥重要作用。已有研究证实FOX03a可以调节超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氯酶(CAT)等抗氧化物质。许多研究表明FOX03a在急性肾损伤、DN等多种肾脏疾病中起着重要的作用。细胞凋亡作为细胞死亡的一种方式,参与肾脏生理学重塑,使肾脏细胞减少,结构改变。糖尿病病人和链脲佐霉素(STZ)诱导的糖尿病小鼠模型中都表现出近端肾小管上皮细胞的凋亡。P53是一种肿瘤抑制基因,研究表明包括DN在内的多种肾脏病中P53的表达是增高的。P53可以增加足细胞,系膜细胞及肾小管上皮细胞的凋亡,从而导致肾脏损伤。沉默信息调节因子(Sir2)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖的脱乙酰化酶,目前哺乳类动物Sir2中发现7种沉默信息调节因子(SIRTs),目前为止SIRT1被认为是与人类Sir2直接同源并且是研究最多的Sir2。SIRT1可以通过其脱乙酰化活性调节多条信号通路,SIRT1不仅可以脱乙酰化组蛋白并且可以脱乙酰化非组蛋白,比如 FOXO、P53、NF-κB、PGC-1a、PARP、Ku70 等。SIRT1在凋亡反应和氧化应激反应中具有重要的调节作用。有研究表明SIRT1通过与FOXO3a直接结合并脱乙酰化FOXO3a,调节FOX03a的转录活性,降低氧化应激损伤。然而,SIRT1/FOX03a在高糖刺激的肾小管上皮细胞抗氧化应激方面的作用目前研究较少。许多研究还发现SIRT1通过去乙酰化P53蛋白第382位的赖氨酸残基来抑制P53的活性,从而降低P53对其下游靶基因的激活作用,减少细胞凋亡。故在防治DN发生和发展的进程中SIRT1可以作为新的作用靶点。白藜芦醇(RSV)作为SIRT1激动剂被人们熟知,是一种天然的多元酚类物质,在葡萄皮中含量丰富,具有广泛的生物学活性和药理作用,如抗氧化、抗凋亡、抗炎、抗癌、心血管保护作用等,为许多疾病提供了有效的治疗方法。但是RSV抑制或延缓糖尿病相关的肾小管氧化应激和凋亡的具体机制并不明确。据上所述,我们提出以下假说:高糖可以导致SIRT1的表达降低,在糖尿病大鼠肾脏中,SIRT1的减少可以通过增加乙酰化FOXO3a和乙酰化P53的表达水平而引发一系列氧化应激和凋亡反应,而白藜芦醇治疗可以通过增加SIRT1表达及其脱乙酰化活性而抑制乙酰化FOXO3a和乙酰化P53的表达水平,从而抑制由高糖引发的氧化应激和凋亡反应。为验证以上假说,我们将首先检测糖尿病大鼠肾脏中的SIRT1及其脱乙酰化活性、FOXO3a及乙酰化FOXO3a蛋白表达水平、P53及乙酰化P53蛋白表达水平、各氧化应激因子和凋亡因子的变化,然后利用体外高糖刺激的人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)寻找上述指标变化的机制。研究方法我们分别用体内实验和体外实验研究白藜芦醇对糖尿病大鼠肾组织中氧化应激反应的抑制作用及其机制。采用STZ(60 mg/kg)诱导的大鼠作为糖尿病动物模型,动物随机分为三组:正常对照组,糖尿病组,糖尿病+白藜芦醇组(30 mg·kg-1·d-1)。治疗16周后,留尿、称重、抽血、取肾用于后续分析;HK-2细胞给予白藜芦醇(25 μM)预刺激2 h后,加入高糖(30 mM)刺激72 h。为了进一步研究SIRT1在高糖诱导的肾小管上皮细胞氧化应激中的作用,我们采用了S1RT1 siRNA或CON siRNA转染到体外培养的HK-2细胞中,利用western b1ot和RT-PCR的方法检测转染效率后,将转染的HK-2细胞继续培养在高糖环境中加入或不加入白藜芦醇(25 μM)培养72 h。实验室方法检测大鼠肾重/体重、空腹血糖和内生肌酐清除率;大鼠肾脏糖原沉积及纤维化情况采用PAS、masson染色评估;免疫组织化学染色检测大鼠肾脏中SIRT1的表达;特异的检测试剂盒检测大鼠肾脏组织及HK-2细胞中的SIRT1脱乙酰化活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量;western blot方法检测大鼠肾脏组织和HK-2细胞中SIRT1、FOXO3a、过氧化氢酶(CAT)的蛋白表达;免疫共沉淀反应检测大鼠肾脏组织及HK-2细胞乙酰化FOX03a的蛋白表达。为明确白藜芦醇对糖尿病大鼠肾组织凋亡反应的抑制作用及其机制,糖尿病大鼠成模采用一次性腹腔内注射STZ(60 mg/kg),动物随机分为三组:正常对照组,糖尿病组,糖尿病+白藜芦醇组(30 mg · kg-1 · d1)。治疗16周后,称重、抽血、取肾用于后续分析:HK-2细胞分别给予高糖刺激0h,24h,48h,72 h检测高糖诱导时间对凋亡的影响。白藜芦醇(25 μM)预刺激2h后,给予高糖(30 mM)刺激72 h,验证白藜芦醇对高糖诱导的凋亡反应的影响。为了进一步研究SIRT1在高糖诱导的HK-2细胞凋亡中的作用,我们采用了 SIRT1 siRNA或CON siRNA转染到体外培养的HK-2细胞中,利用western blot和RT-PCR的方法检测转染效率后,将转染的HK-2细胞继续培养在高糖环境中加入或不加入白藜芦醇(25 μM)培养72 h。实验室方法检测大鼠肾重/体重、空腹血糖、血肌酐和尿素氮;大鼠肾脏糖原沉积及纤维化情况采用PAS、masson染色评估;免疫组织化学染色检测大鼠肾脏中SIRT1的表达;特异性试剂盒检测SIR1脱乙酰化活性、caspase-3活性、caspase-9活性;JC-1染色检测线粒体膜电位梯度;Hoecst33258染色检测细胞核形态;western blot方法检测大鼠肾脏组织和 HK-2 细胞中 cleaved caspase-3、cleaved PARP、SIRT1、P53 和乙酰化 P53 的蛋白表达。研究结果1.白藜芦醇通过增加SIRT1脱乙酰化FOXO3a改善糖尿病大鼠肾脏的氧化应激1.1白藜芦醇改善糖尿病大鼠代谢指标及肾脏纤维化等病理异常与糖尿病(DM)组相比,白藜芦醇治疗后空腹血糖无明显改善,肾重/体重显著降低,肌酐清除率显著上升,白藜芦醇治疗组大鼠肾脏糖原沉积明显减少。与DM组相比,白藜芦醇治疗组的肾小球硬化明显改善。Masson染色结果表明糖尿病大鼠肾脏纤维化程度可通过白藜芦醇治疗显著改善。1.2白藜芦醇对糖尿病大鼠肾脏SIRT1表达及氧化应激指标的影响免疫组织化学染色结果示DM组大鼠肾脏组织中SIRT1的表达较正常对照组明显减少,白藜芦醇治疗后明显增多。白藜芦醇治疗糖尿病大鼠后其肾组织中SOD活性较DM组明显增多、MDA含量明显减少。Western blot结果显示白藜芦醇治疗组糖尿病大鼠肾脏组织中SIRT1、CAT蛋白表达较DM组明显增加,但是FOXO3a的蛋白水平没有变化。白藜芦醇治疗糖尿病大鼠后其肾组织SIRT1脱乙酰化活性较DM组明显增加。同时IP结果发现白藜芦醇治疗组大鼠肾脏组织中乙酰化FOX03a的蛋白表达较DM组明显下降。1.3白藜芦醇缓解高糖刺激的肾小管上皮细胞中氧化应激损伤并增加SIRT1的脱乙酰化活性与高糖(HG)组相比,白藜芦醇干预可以缓解高糖导致的HK-2细胞中SOD的减少和MDA、ROS的增加。Western blot检测结果发现白藜芦醇干预组HK-2细胞中SIRT1和CAT的蛋白表达较HG组明显上升,但FOX03a的蛋白表达没有变化。高糖培养的HK-2细胞中SIRT1脱乙酰化活性明显降低,但是白藜芦醇干预可以缓解这一变化。同时IP结果发现高糖培养的HK-2细胞中乙酰化FOX03a的蛋白水平比低糖培养的HK-2细胞中高,并且白藜芦醇可以降低高糖导致的这一高水平乙酰化FOX03a表达。同时结果还显示渗透压并不影响上述氧化应激指标的表达。1.4 SIRT1对高糖刺激的肾小管上皮细胞中氧化应激的影响SIRT1 siRNA转染后使HK-2细胞内源性SIRT1的蛋白表达及基因水平均减少65%。CON siRNA转染HK-2细胞后,白藜芦醇干预可以显著改善高糖引起的SOD减少,MDA、ROS和乙酰化FOX03a的增多。与CON siRNA转染相比,SIRT1 siRNA转染的HK-2细胞显示出SOD明显减少、MDA、ROS和乙酸化FOX03a明显增多,但是SIRT1siRNA转染HK-2细胞后,白藜芦醇干预并不能改善高糖引起的以上氧化应激指标的变化。2.白藜芦醇通过调控SIRT1/P53缓解糖尿病大鼠肾脏的凋亡反应2.1白藜芦醇改善糖尿病大鼠代谢指标及肾脏纤维化等病理异常与DM组相比,白藜芦醇治疗后空腹血糖、血肌酐、尿素氮无明显改善,肾重/体重明显下降。PAS染色显示白藜芦醇治疗组大鼠肾脏糖原沉积较DM组明显减少。与DM组相比,白藜芦醇治疗组的肾小球硬化明显改善。Masson染色结果表明白藜芦醇治疗可显著改善糖尿病大鼠肾脏纤维化程度。2.2白藜芦醇对糖尿病大鼠肾脏SIRT1表达及凋亡指标的影响免疫组织化学染色结果及western blot结果示DM组大鼠肾脏组织中SIRT1的表达较正常对照组明显减少。与正常对照组相比,DM组大鼠肾脏组织中caspase-3及caspase-9活性均明显增加。Western blot结果显示与正常对照组比较,DM组cleaved caspase-3、cleaved PARP的蛋白显著增多,白藜芦醇治疗后上述指标均能明显改善。2.3白藜芦醇使糖尿病大鼠肾组织中SIRT1的脱乙酰化活性增加并能降低乙酰化P53的蛋白表达白藜芦醇治疗糖尿病大鼠后其肾组织SIRT1脱乙酰化活性较DM组明显增加。同时western blot结果发现白藜芦醇治疗组大鼠肾脏组织中乙酰化P53的蛋白表达较DM组明显下降。2.4高糖对肾小管上皮细胞凋亡反应及SIRT1的脱乙酰化活性的影响与高糖刺激0 h(HGOh)相比,高糖刺激72h后HK-2细胞中MTT结果表现出细胞存活率显著降低、JC-1染色结果显示线粒体膜电位显著降低、Hoechst33258染色结果显示细胞核分裂显著增加。高糖刺激48h、72h后,HK-2细胞的caspase-3活性明显增加。Western blot检测结果发现高糖刺激48 h、72 h后HK-2细胞中cleaved caspase-3、cleaved PARP的蛋白水平较HGOh组明显上升,SIRT1的蛋白表达较HGOh组明显减少。高糖刺激48h、72h后HK-2细胞的SIRT1脱乙酰化活性明显减少。Western blot结果显示48 h、72 h后HK-2细胞的乙酰化P53的蛋白水平明显增多,但P53的蛋白水平没有变化。2.5白藜芦醇对高糖刺激的肾小管上皮细胞中凋亡指标及SIRT1脱乙酰化活性的影响MTT结果显示低糖状态下白藜芦醇(5 μM,10 μM,25 μM)干预对HK-2细胞的细胞存活率没有影响,但是高糖状态下25 μ白藜芦醇治疗可以显著增加HK-2细胞的存活率。与HG组相比,白藜芦醇干预组HK-2细胞中JC-1染色结果显示线粒体膜电位显著升高、Hoechst33258染色结果显示细胞核分裂显著减少、caspase-3活性显著降低。Western blot结果示,白藜芦醇干预显著减少高糖诱导的cleaved caspase-3及cleaved PARP的蛋白水平。与HG组相比,白藜芦醇干预使HK-2细胞的SIRT1蛋白表达及脱乙酰化活性显著升高,并且减少乙酰化P53的蛋白含量,但是对P53的蛋白含量无明显变化。结果还显示在低糖和甘露醇组,以上指标的改变没有统计学意义。2.6 SIRT1对高糖刺激的肾小管上皮细胞中凋亡的影响SIRT1 siRNA转染后使HK-2细胞SIRT1的蛋白表达减少60%及基因水平减少65%。CON siRNA转染HK-2细胞后,白藜芦醇干预可以显著改善高糖引起的细胞核分裂、caspase-3活性、cleaved caspase-3蛋白水平、cleaved PARP蛋白水平及乙酰化P53蛋白水平的增加,显著改善高糖引起的线粒体膜电位和SIRT1脱乙酰化活性降低。与CONsiRNA转染相比,SIRTIsiRNA转染的肾小管上皮细胞显示出细胞核分裂、caspase-3活性、cleaved caspase-3蛋白水平、cleaved PARP蛋白水平及乙酰化P53蛋白水平的增加,线粒体膜电位和SIRT1脱乙酰化活性降低。但是SIRT1 siRNA转染HK-2细胞后,白藜芦醇干预并不能改善高糖引起的以上凋亡指标的变化。结论1.白藜芦醇治疗可以延缓DN的进展,降低肾重/体重,改善肾功能。2.白藜芦醇减轻STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏纤维化。3.白藜芦醇的作用机制与增加SIRT1的表达相关。白藜芦醇通过增加SIRT1脱乙酰化活性,降低乙酰化FOXO3a的含量,减轻高糖引起的氧化应激损伤。4.高糖状态下,白藜芦醇的保护机制与降低乙酰化P53水平相关。白藜芦醇通过减少乙酰化P53的含量,缓解高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡。