目的:1.建立稳定的BRVO大鼠模型,寻找合理的评价方式,为临床药物干预治疗提供实验依据。2.观察剔络化瘀方对视网膜静脉阻塞大鼠模型视网膜血管的保护作用,以及对ICAM-1因子,凝血、血流变功能的影响。3.评估剔络化瘀方对视网膜分支静脉阻塞患者患眼及对侧眼黄斑区血流密度的影响,定量评估剔络化瘀方的作用机理。方法:1.采用532nm氪绿激光照射尾静脉注射孟加拉红溶液的SD大鼠眼底静脉,建立BRVO大鼠模型。通过苏木精-伊红染色法观察大鼠视网膜病理组织变化,视网膜消化铺片观察视网膜血管形态变化,彩色眼底照相、眼底荧光血管造影(Fundus fluorescein angiograph,FFA)及超广角眼底血管造影(Ultra-widefield fluorescein angiography,UWFA)观察眼底表现及血管再通情况。2.随机分为正常组,余SD大鼠建立BRVO模型,造模后随机分为模型组、复方血栓通组、剔络化瘀方低、中、高剂量组,除正常组外其余各组在造模后2h开始灌胃。于1d、3d、7d、21d综合眼底照相、周边视网膜照相、FFA评判大鼠眼底特征、血管再通情况得分,观察视网膜组织切片HE染色、血清中ICAM-1的变化;观察3d、7d、21d视网膜消化铺片,凝血、血液流变学的改变。3.采用前瞻性研究方法,纳入符合标准的BRVO患者,以剔络化瘀方为干预手段,治疗组患者予口服中药剔络化瘀方,入组时CRT高度>500μm,玻璃体腔注射抗VEGF药物1次;访视CRT高度,较上次访视增加>100μm,玻璃体腔注射抗VEGF药物1次。记录治疗前、治疗后4、8、12周正常眼、治疗组双眼(患眼和对侧眼)的临床资料,包括最佳矫正视力、浅层视网膜血流密度(Superficial capillary plexus,SCP)、深层视网膜血流密度(Deep capillary plexus,DCP)、黄斑中心凹视网膜厚度(Central retinal thickness,CRT),黄斑中心凹血管区(FAZ)面积及抗VEGF药物注射次数。结果:1.制备BRVO大鼠模型共30只(右眼),未发生死亡,检眼镜下观察,模型成功率为100%。正常组眼底彩照示视网膜呈淡红色,视盘居中,动静脉血管管径均匀,呈放射状相间分布,隐约可见脉络膜血管。FFA示视网膜充盈时间正常,静脉较动脉管径粗,无毛细血管扩张及荧光渗漏。HE染色视网膜层次清晰,结构整齐,节细胞层、内核层、外核层细胞排列紧密。视网膜消化铺片示视网膜呈连续树枝状,管径粗细一致,可见动脉、静脉及毛细血管网,动脉染色较深,静脉染色较浅。血管壁外侧可见圆形或三角形,核较小,着色深的周细胞,血管内可见椭圆形,核较大,着色浅的内皮细胞,各血管分布规则,走形规整。模型组眼底彩照示1d视网膜散在火焰状出血,血栓形成,静脉血流中断,呈腊肠样改变,走形迂曲,阻塞区网膜水肿;3d阻塞静脉管径不均,走形迂曲,视网膜颞侧见黄白色渗出及火焰状出血;7d视网膜色淡白,静脉迂曲,管径不均。14d视网膜色淡红,血管呈放射状走形,管径均匀。21d视网膜色淡,静脉较细,血管走形尚可。FFA示1d视网膜静脉充盈迟缓,管径扩张,走形迂曲,阻塞部血管呈低荧光及节段样荧光充盈,部分出血遮蔽荧光,视网膜轻度渗漏。3d部分血管再通,管壁荧光着染,阻塞静脉供应区可见毛细血管扩张、NP区。7d、14d、21d视网膜充盈时间正常,阻塞静脉血管通畅,走形迂曲,管径不规则,可见侧支循环形成。HE染色模型组视网膜血管腔内可见红细胞聚集,网膜水肿,细胞排列疏松,外丛状层、内核层可见空腔样改变。视网膜消化铺片示视网膜血管染色浅分布疏松,阻塞静脉血管内皮细胞、周细胞缺失,管径不均,可见血管闭锁、无细胞毛细血管及无细胞的小静脉血管。2.(1)1d模型组大鼠与复方血栓通组、剔络化瘀方低、中、高剂量组两两比较均差异无统计学差异(P>0.05);3d干预治疗后,剔络化瘀方低、中、高剂量组、复方血栓通组与模型组比较可以改善眼底特征和血管再通情况,差异具有统计学差异(P<0.05),剔络化瘀方低剂量组和复方血栓通组干预后由典型特征转为中度典型特征;剔络化瘀方中剂量和高剂量组由典型特征转为不典型特征,组间比较不具有统计学差异(P>0.05),7d药物干预组特征转为不典型,剔络化瘀方高剂量组与正常组比较无差异(P>0.05);模型组1d与3d均具有典型眼底特征,两组间无统计学差异(P>0.05),21d模型组大鼠视网膜在眼底表现、血管再通评价转为不典型。复方血栓通组、剔络化瘀方低剂量、中剂量组各时间点治疗前后存在统计学差异(P<0.05);剔络化瘀方高剂量组7d与21d 比较不具有统计学差异(P>0.05)。(2)正常组视网膜层次清晰,神经节细胞富集,内核层、外核层细胞排列整齐。1d模型组和各药物干预组视网膜各层细胞排列疏松,部分缺失,呈空洞样改变,内核层可见红细胞;复方血栓通组和剔络化瘀方低、中、高剂量组在21d未发生萎缩变性。正常组视网膜动脉染色深,静脉浅,毛细血管网均匀分布,走形流畅,血管腔外侧为核小且深染的周细胞,管腔内为浅染的梭形内皮细胞。3、7、21d:模型组视网膜可见多处无细胞毛细血管,大量周细胞脱失,血管分布随时间延长逐渐疏松;复方血栓通组:无细胞毛细血管数较模型组大鼠少,血管管径均匀,21d毛细血管间隙变大;剔络化瘀方低剂量组:血管管径均匀,走形柔和,无细胞毛细血管数较模型组、复方血栓通组少;剔络化瘀方中剂量组:血管分布一致性好,无细胞毛细血管较复方血栓通组和剔络化瘀方低剂量组减少:剔络化瘀方高剂量组:视网膜血管管径较粗,无细胞毛细血管、凋亡细胞较少。(3)1d、3d组内比较具有显著统计学差异(P<0.01)。1d、3d模型组ICAM-1水平升高,1d高于3d,与正常组比较具有显著统计学差异(P<0.01),7d模型组ICAM-1值小于3d模型组,差异具有统计学意义(P<0.05),7d模型组ICAM值小于21d模型组,差异不具有统计学意义(P>0.05)。1d、3d复方血栓通组、剔络化瘀方低剂量、中剂量、高剂量ICAM值低于模拟型组,差异有明显统计学意义(P<0.01),药物干预组间比较无差异(P>0.05),高剂量组ICAM-1水平较其他组低。(4)3d模型组与正常组比较凝血酶原时间显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01);3d所有药物干预组较模型组凝血酶原时间提高,具有显著差异(P<0.01),3d模型组APTT较正常组缩短,差异具有统计学意义(P<0.05);复方血栓通组、剔络化瘀方低、高剂量组比模型组升高,差异具有统计学意义(P<0.05);3d纤维蛋白原模型组较正常组增高,差异具有统计学意义(P<0.05);剔络化瘀方高剂量组与模型组比较纤维蛋白原含量低,差异具有统计学意义(P<0.05),剔络化瘀方高剂量组较正常组纤维蛋白原含量低,差异不具有统计学意义(P>0.05),提示剔络化瘀方高剂量组可以降低纤维蛋白原含量,改善血液循环。7、21d活化部分凝血活酶时间、纤维蛋白原2个凝血因子与正常组比较,不具有统计学差异(P>0.05)。(5)3d全血粘度1(1/s)、全血粘度50(1/s)、全血粘度200(1/s)、血浆粘度、红细胞聚集指数模型组较正常组升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,复方血栓通组、剔络化瘀方低、中、高剂量组可降低全血粘度1(1/s)、全血粘度50(1/s)、红细胞聚集指数、血浆粘度,差异具有统计学意义(P<0.05);剔络化瘀方中剂量组降低全血粘度1(1/s)较复方血栓通组程度大,差异具有统计学意义(P<0.05)。与其他治疗组比较,剔络化瘀方中剂量组显著降低全血粘度50(1/s),具有显著统计学差异(P<0.01),较复方血栓通组降低程度大、效果好,差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较复方血栓通组、剔络化瘀方中剂量、高剂量组可降低全血粘度200(1/s),差异具有统计学意义(P<0.05),剔络化瘀方低剂量组降低全血粘度200(1/s)与模型组相比程度小,不具有统计学差异(P>0.05)。7d全血粘度1(1/s)、全血粘度50(1/s)、全血粘度200(1/s)模型组较正常组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组比较复方血栓通组、剔络化瘀方中剂量、高剂量可显著降低全血粘度1(1/s),具有显著统计学意义(P<0.01);剔络化瘀方低剂量降低全血粘度1(1/s)程度不及其余药物干预组,差异具有统计学意义(P<0.05);剔络化瘀方中剂量组较低剂量组降低全血粘度1(1/s),差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较复方血栓通组、剔络化瘀方低剂量、中剂量、高剂量可降低全血粘度50(1/s),差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较复方血栓通组、剔络化瘀方低剂量、高剂量组可降低全血粘度200(1/s),差异具有统计学意义(P<0.05),剔络化瘀方中剂量组显著降低全血粘度200(1/s)具有显著统计学差异(P<0.01)。7d血浆粘度、红细胞聚集指数各组内两两比较,不具有统计学差异(P>0.05)。21d各组全血粘度1(1/s)、全血粘度50(1/s)、全血粘度200(1/s)、血浆粘度、红细胞聚集指数比较,无统计学差异(P>0.05)。3.(1)治疗组与正常组比较:浅层视网膜血流密度、深层视网膜血流密度减少,LogMAR视力、黄斑中心凹视网膜厚度增加,差异具有显著统计学意义(P<0.01);黄斑区无血管区面积扩大,差异具有统计学意义(P<0.05)。治疗组LogMAR视力与黄斑中心凹视网膜厚度、黄斑中心凹血管区(FAZ)呈正相关,差异具有显著统计学意义(P<0.01);LogMAR视力与深层毛细血管层血流密度呈负相关,差异具有统计学意义(P<0.05);LogMAR视力与浅层毛细血管层血流密度无相关,差异无统计学意义(P>0.05)。黄斑中心凹无血管区面积与深层毛细血管层血流密度呈负相关,差异具有显著统计学意义(P<0.01);黄斑中心凹无血管区面积与浅层毛细血管层血流密度无相关,差异无统计学意义(P>0.05)。黄斑中心凹视网膜厚度与深层毛细血管层血流密度呈负相关,差异具有统计学意义(P<0.05)。黄斑中心凹视网膜厚度与浅层毛细血管层血流密度无相关,差异无统计学意义(P>0.05)。(2)治疗组患眼与对侧眼SCP分别为43.80±2.89%和49.63±3.42%,DCP分别为38.65±1.97%和48.28±2.92%,患眼SCP、DCP较低,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。(3)治疗组患眼与治疗前比较:访视4周SCP增加,差异具有统计学意义(P<0.05),DCP虽有增加,但差异不具有统计学意义(P>0.05);访视8周、12周SCP、DCP增加,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。与访视4周比较:访视8周SCP增加,但差异不具有统计学意义(P>0.05);DCP增加,差异具有显著统计学意义(P<0.01);访视12周SCP、DCP均增加,差异具有统计学意义(P<0.01)。与访视8周比较:访视12周SCP增加,差异具有统计学意义(P<0.05),DCP增加较明显,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。访视4周、8周、12周FAZ面积分别为0.37±0.07,0.39±0.07,0.41±0.07,FAZ面积逐渐扩大,访视4周、访视8周、访视12周较治疗前比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。LogMAR BCVA 视力治疗后,分别为 0.49±0.23,0.39±0.15,0.29±0.11,由治疗前 0.58±0.23提高至0.29±0.11,访视8周、访视12周较治疗前比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。黄斑中心凹视网膜厚度CRT治疗后,分别为401.40±152.71,331.87±61.68,272.73±21.30,黄斑水肿减轻,访视4周较治疗前,差异不具有统计学意义(P>0.05),访视8周、访视12周较治疗前比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)治疗组对侧眼与治疗前比较:访视4周SCP、DCP,差异不具有统计学意义(P>0.05);访视8周SCP、DCP增加,差异具有统计学意义(P<0.05);访视12周SCP、DCP增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。与访视4周比较:访视8周SCP增加,差异具有显著统计学意义(P<0.01);DCP增加,差异具有统计学意义(P<0.05);访视12周SCP、DCP增加,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。与访视8周比较:访视12周视网膜SCP增加,差异具有统计学意义(P<0.05);DCP增加,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。(5)治疗组玻璃体腔注射抗VEGF药物平均次数0.5次,其中4人注射2次、6人注射1次、20人未注射。结论:1.采用尾静脉注射光敏剂孟加拉红溶液(50mg/ml),光动力法532nm氪绿激光,能量70mw,光斑直径100 μ m,曝光时间0.4s,成功制备大鼠BRVO模型。模型成功率为100%,可较好模拟人体BRVO特点,为临床药物基础研究提供支持。2.剔络化瘀方改善BRVO大鼠眼底特征表现、加快血液流动,减轻网膜水肿,改善血流变状态,激活纤溶系统,促进血管再通,继而改善BRVO大鼠模型视网膜血液微循环。剔络化瘀方保护视网膜毛细血管结构,减少内皮细胞、周细胞脱失,降低无细胞毛细血管数量。剔络化瘀方低、中、高剂量组抑制ICAM-1的表达,以剔络化瘀方高剂量组抑制幅度大,效果好。3.口服剔络化瘀方可以提高BRVO黄斑水肿患者视力,降低黄斑中心凹厚度,增加视网膜血流密度,改善视网膜微循环,可明显减少或不联合抗VEGF药物使用,同时发现在未进行玻璃体腔注射的对侧眼8周、12周血流密度增加,更加证实中药剔络化瘀方在改善视网膜微循环方面存在作用。