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芒草是目前最具开发潜力的高产纤维类能源植物之一。瘤胃是自然界中高效的纤维素降解系统之一,含有丰富的纤维素降解微生物及其编码的纤维素酶。深入研究芒草在瘤胃微生物中的降解机制,寻找高效降解纤维素的新基因资源是有效解决能源作物芒草生物降解从而加速其开发利用的重要途径之一。β-葡萄糖苷酶在纤维素的糖化水解过程中具有关键作用,β-葡萄糖苷酶Unglu135B12是从芒草驯养牛瘤胃宏基因组文库中克隆得到的一个酶活性很高但热稳定性不足的β-葡萄糖苷酶。本论文以混合饲料饲养牛(Rumen1)和芒草驯养牛(Rumen2)瘤胃微生物为研究对象,利用高通量测序技术研究了芒草驯养牛瘤胃微生物群落生态结构、功能基因以及纤维素酶的组成与混合饲料饲养牛的差异;以β-葡萄糖苷酶Unglu135B12为研究对象,通过易错PCR、定点突变和计算机辅助模拟相结合的技术对其进行热稳定分子改造,为微生物来源的β-葡萄糖苷酶的体外分子改造研究提供参考。牛瘤胃宏基因组高通量测序研究结果显示,Rumen1共获得了10.86G的数据量,GC含量50.64%,组装得到244,320个Contigs,预测有659,076个ORFs。Rumen2共获得了11.65G的数据量,GC含量50.29%,组装获得282,938个Contigs,预测有764,177个ORFs。物种注释分析结果表明,瘤胃中含有丰富的纤维素降解微生物,Rumen1的物种多样性高于Rumen2。变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门是瘤胃微生物的优势菌,Rumen1的拟杆菌门和厚壁菌门的物种丰度高于Rumen2。芒草驯养使得Rumen2的不动杆菌属和普氏菌属的丰度高于Rumen1。功能基因注释显示,瘤胃微生物主要参与碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢等多种途径,Rumen1与Rumen2在糖酵解、三羧酸循环、磷酸戊糖途径、甲烷代谢以及氮循环的功能基因的丰度不同。碳水化合物活性酶注释显示,Rumen1含有5070个糖苷水解酶(GHs)、3254个糖基转移酶(GTs)、179个多糖裂合酶(PLs)、2079个碳水化合物酯酶(CEs)、313个辅助氧化还原酶(AAs)、2140个碳水化合物结合模块(CBMs)、255个对接蛋白(Dockerin)、54个黏连蛋白(Cohesin)和231个S层同源结构域(SLHs),共计13575个碳水化合物活性酶,Rumen2含有6847个GHs、4042个GTs、269个PLs、2608个CEs、312个AAs、3033个CBMs、253个Dockerin、60个Cohesin和205个SLHs,共计17629个碳水化合物活性酶。GH家族分析表明,GH5、GH9、GH44、GH45和GH48在纤维素降解过程中发挥主要作用。Rumen2的GH1、GH8、GH9、GH10、GH11、GH30、GH35、GH42、GH57、GH74、GH95、GH106、GH115和GH124家族的丰度高于Rumen1的1.5倍以上。选取10个牛瘤胃宏基因组GH3家族新基因克隆验证,有6个基因具有β-葡萄糖甘酶活性。通过易错PCR技术构建突变文库,最终筛选得到热稳定性提高的突变β-葡萄糖苷酶ep-mut21(R72Y/N273A/V520P)和ep-mut48(W232F/T389G)。ep-mut21的最适温度为46.8°C,最适pH为5.8,Km值为0.142 mmol/L,催化效率提高了2.7倍,50°C半衰期提高了2.5倍(14.6 min),酶活提高了2.6倍(5.72×10~3U/mg)。ep-mut48最适温度43.2°C,最适pH5.2,Km值为0.207 mmol/L,催化效率提高了1.9倍,50°C半衰期达到13.5 min,酶活提高了2.1倍(4.62×10~3U/mg)。通过定点饱和突变技术筛选获得了热稳定性优于野生型的突变体D86Q、K191D和W271Y。突变体D86Q的最适温度46.8°C,最适pH5.2,催化效率提高了2.7倍,50°C半衰期14.6 min,酶活达到4.84×10~3U/mg。突变体K191D最适温度46.8°C,最适pH5.2,50°C半衰期11.2 min,酶活为1.95×103·U/mg。W271Y最适温度46.8°C,最适pH5.8,Km值0.143 mmol/L,催化效率提高了1.5倍,50°C半衰期是8.9 min,酶活达到2.86×10~3·U/mg。亲核基团D270和酸/碱基团E477丙氨酸突变后酶活几乎丧失,突变为甘氨酸后,突变体酶与底物的亲和力增强,催化效率降低,酶活降低。突变体结构分析表明,突变体ep-mut21热稳定性提高可能与R27Y的电势改变、N273A的空间结构变大、V520P的刚性增强等有关,突变体ep-mut48的热稳定性提高可能与W232F形成的caption-pi键,T389G的疏水作用有关,K191D、W271Y的热稳定性提高与氢键作用有关。综上所述,牛瘤胃内含有丰富的木质纤维素降解微生物及酶系,芒草驯养改变了微生物群落组成及纤维素酶的丰度,为筛选具有工业应用潜力的芒草降解酶基因提供了指导。经改造的Unglu135B12重组酶热稳定性有所提高,同时保持了良好的酶活,为工业化生产及应用提供依据。