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MHC-肽四聚体(Peptide-MHC tetramer)技术是免疫学和临床诊断中重要的技术,广泛应用于免疫学研究及免疫性疾病临床研究。研究证实,T细胞是通过TCR识别靶细胞或抗原递呈细胞表面MHC分子结合的特异性表位肽复合体,但这种特异性识别亲和力低,迅速发生解离。MHC-肽四聚体复合物的原理是通过增强T细胞受体与MHC-肽复合物亲和力,达到可直接特异性检测T细胞的目的。该法的优势在于迅速、直接、灵敏且特异性强,但也存在复性率低、步骤繁琐等缺点。虽然研究者对MHC-肽四聚体的制备技术做了很多改进,但仍未很好地解决这些问题。MHC-I分子限制性的CTL表位鉴定一直是免疫学的热点,是基于表位进行免疫诊断、免疫治疗、疫苗开发的关键。传统的CTL表位鉴定方法主要采用先合成大量的交叠肽,再通过后续淋巴细胞实验进行选取,存在费时、费力、费用大、鉴定效率低等缺点。有研究者用TAP(Transporters associated with antigen processing)缺陷细胞T2细胞,采用肽亲和力实验进行表位鉴定,取得了很好的结果,但繁琐的标记、染色及反复洗涤细胞过程可能对细胞造成的损伤是限制该方法广泛应用的主要原因。众所周知,DsRed和ZsGreen均表达为四聚体结构的荧光蛋白,所以,我们设想将MHC-I分子和ZsGreen在真核细胞中融合表达,直接获取MHC-四聚体,简化传统制备MHC-四聚体中繁琐的原核表达、折叠、生物素化、荧光标记等过程,且构建的MHC-四聚体理论上可加载任意感兴趣的抗原肽,使检测更加灵活。而运用此原理将β2M和ZsGreen融合表达获得β2M四聚体,该融合蛋白理论上可以和MHC-I、特异性表位肽结合形成MHC-肽四聚体。利用此原理,将此融合蛋白应用于肽亲和力实验,可能极大地改进CTL表位鉴定方法。目的:本研究试图运用分子克隆技术、真核表达、镍亲和层析法纯化等方法直接获得MHC-四聚体,优化MHC-肽四聚体制备技术,并将该技术运用于MHC-肽亲和力实验,改进CTL表位鉴定方法。方法:1.通过PCR技术得到小鼠MHC-Ⅰ分子的可溶性部分sKb的DNA序列,并运用分子克隆技术将这段DNA片段与4×GGGS-ZsGreen-6×His载入包装质粒FUGW的载体中,构建sKb-GGGS-ZsGreen-6×His标签的融合蛋白真核表达质粒FUsKbZsGreenGGGS;2.运用细胞转染技术,将FUsKbZsGreenGGGS转染293FT细胞,融合表达sKbZsGreenGGGS;3.裂解表达sKbZsGreenGGGS的293FT细胞,利用融合蛋白所带的6×His标签,镍亲和层析法纯化sKbZsGreenGGGS,并脱盐、浓缩;4.将sKbZsGreenGGGS和β2M、OVA肽组装后得到MHC-OVA肽四聚体,该四聚体与B3Z细胞反应,流式细胞术检测;5.通过PCR技术得到人β2M分子的DNA序列,并运用分子克隆技术将这段DNA片段与4×GGGS-ZsGreen-6×His载入包装质粒FUGW的载体中,构建β2M-GGGS-ZsGreen-6×His标签的融合蛋白真核表达质粒FUβ2MZsGreenGGGS;6.运用细胞转染技术,将FUβ2MZsGreenGGGS转染293FT细胞,将β2M-GGGS-ZsGreen-6×His片段嵌入293FT细胞基因组DNA,融合表达β2MZsGreenGGGS;7.裂解表达β2MZsGreenGGGS的293FT细胞,利用融合蛋白所带的6×His标签,镍亲和层析法纯化β2MZsGreenGGGS,并脱盐、浓缩;8.将β2MZsGreenGGGS和表位肽共同与TAP缺陷细胞T2细胞反应,通过流式细胞术检测T2细胞标记绿色荧光的情况鉴定表位,并与传统肽亲和力实验对比。机制探讨:1. MHC-肽四聚体技术的优化通过将MHC-Ⅰ分子和ZsGreen融合表达,直接构建带绿色荧光的MHC-Ⅰ四聚体,将该四聚体与特异性表位肽结合后与特异性杂交瘤细胞反应,流式细胞检测,通过细胞染色比例证实所构建的MHC-Ⅰ四聚体复合物可被特异性T细胞识别、结合,对MHC-肽四聚体复合物技术的优化的方法可行。本部分研究利用真核表达、蛋白质纯化技术获得MHC-Ⅰ四聚体,与特异性表位肽及特异性T细胞反应后流式细胞术证实该四聚体具有与特异性表位肽结合并被特异性T细胞识别的能力。2. MHC-肽四聚体技术在表位鉴定中的应用将β2M和ZsGreen融合表达,获得带绿色荧光蛋白的β2M四聚体,将该四聚体与不同的表位肽、T2细胞反应,流式细胞检测,根据T2细胞染色情况鉴定抗原表位。本部分实验运用T2细胞株TAP(Transporters associated with antigen processing)缺陷的特点及β2M促进MHCⅠ类分子与抗原表位肽结合的作用,将β2M四聚体、表位肽及T2细胞反应,阳性肽与β2M四聚体、T2细胞表面少量MHC-Ⅰ分子结合形成稳定的带绿色荧光的MHC-肽四聚体复合物,同时在T2细胞表面标记绿色荧光,通过流式细胞术即可鉴定表位。结论:1.构建了1种MHC-Ⅰ四聚体的真核表达质粒FUsKbZsGreenGGGS并表达、纯化得到sKbZsGreenGGGS,将sKbZsGreenGGGS和β2M、OVA肽组装后被B3Z细胞识别、结合,流式细胞检测;2.构建了β2M-四聚体的真核表达质粒FUβ2MZsGreenGGGS并表达、纯化得到β2MZsGreenGGGS,将β2MZsGreenGGGS与表位肽共同与T2细胞反应,通过流式细胞术检测T2细胞标记绿色荧光的情况鉴定表位;以上研究证实,通过将MHC-Ⅰ分子和ZsGreen融合表达的方法制备MHC-肽四聚体,在技术上可行,而运用这项技术及其原理制备β2M-四聚体,并应用于肽亲和力实验进行表位鉴定,大大简化和优化了表位鉴定的方法,具有广泛的应用前景。