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药效成分含量是影响中草药品质的关键因素之一,由中草药次生代谢产生的一些天然产物是其主要药效成分,研究影响中草药次生代谢产物累积水平的因素,明确其次生代谢途径中的关键调控点,可为调控中草药药效成分累积水平、提高其品质提供理论支持。植物次生代谢产物,特别是许多具有生物活性的次生代谢产物在植物体内的主要功能之一是协助其抵御和适应外界不良环境条件。近年来的研究表明,水杨酸(Salicylic acid,SA)在植物抵御和适应外界不良环境条件过程中发挥着重要作用,它能够改变相关防御基因的表达水平,使得某些次生代谢产物的累积水平发生改变,对植物体内一系列生理状态进行调节,进而提高植物的抗逆性能。通过对SA合成途径进行调节改变SA含量,能够实现对某些次生代谢产物累积水平的调控。植物体内存在苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine lyase,PAL)和异分支酸合成酶(Isochrismate synthase,ICS)两条SA合成途径,而关于PAL和ICS途径在同一材料中分别对SA合成的影响,及各自途径产生的SA对中草药主要药效物质累积水平的影响仍不清晰,为此本实验以黄芩为对象,研究了黄芩PAL和ICS途径分别对游离水杨酸(Free salicylic acid,FSA)和总水杨酸(Total salicylic acid,TSA)合成水平的影响,以及两条途径产生的FSA和TSA分别与黄芩苷和黄芩素含量间的关系。实验中首先利用cDNA末端快速克隆技术(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆了黄芩ICS基因cDNA全长序列,同时根据Genebank中已有的黄芩PAL序列,设计了用于构建基因沉默载体的sics和spal片段,分别构建了pTRV2-sics和pTRV2-spal用于病毒诱导的基因沉默操作(Virus induced gene silence,VIGS)。然后采用VIGS沉默,10、20和40mg/L外源SA喷施,干旱、高盐和高温胁迫等三种方式处理黄芩幼苗,改变其PAL和ICS酶活性,进而改变其FSA和TSA含量,分析了FSA和TSA分别与酶活性间关系以及这两种类型的SA分别与黄芩苷、黄芩素含量间的关系,结果表明:1.基因沉默处理能显著降低PAL和ICS基因的转录水平和酶活,且PAL基因沉默后FSA含量显著降低,TSA含量略有降低;ICS基因沉默后FSA和TSA含量显著降低,但FSA降低幅度减小。FSA和TSA含量降低后黄芩苷含量显著降低,而黄芩素含量未受到明显影响。相关性分析表明FSA和PAL存在正相关(相关系数0.771),与ICS酶存在正相关(酶活未检出);TSA与PAL间存在较强正相关(相关系数0.551),与ICS间存在正相关(酶活性未检出)。FSA与黄芩苷存在显著正相关(相关系数0.592,p<0.05),与黄芩素间存在弱负相关(相关系数-0.301);TSA与黄芩苷间存在弱正相关(相关系数0.049),与黄芩素间存在弱负相关(相关系数-0.219)2.外源SA处理能够显著改变PAL和ICS酶活性。20mg/L处理能够提高PAL和ICS基因的表达水平和酶活性,而10mg/L和40mg/L处理后对PAL和ICS酶活性以抑制为主,这表明外源SA对PAL和ICS基因转录水平和酶活性的影响存在一定浓度效应;相关性分析表明FSA和PAL酶存在极显著的强正相关(相关系数0.883,p<0.01),与ICS酶存在较强的正相关(相关系数0.586);TSA与PAL间存在较强正相关(相关系数0.517),与ICS间存在较强正相关(相关系数0.510)。FSA与黄芩苷存在强的正相关(相关系数0.667,p<0.05),与黄芩素间存在弱负相关(相关系数-0.133);TSA与黄芩苷间存在弱正相关(相关系数0.267),但与黄芩素间存在较强的负相关(相关系数-0.65,p=0.058)。3.干旱、高盐和高温三种胁迫条件对PAL和ICS酶活性影响存在差异,其中干旱处理表现为抑制,高盐和高温处理表现为促进;当PAL和ICS酶活性增大/减小时,FSA和TSA也增大/减小;FSA和TSA含量减小/增大时黄芩苷含量减小/增大,而TSA减小/增大时黄芩素增大/减小。相关性分析表明FSA与PAL具有显著性正相关(相关系数0.651,p<0.05),与ICS具有弱正相关(相关系数0.429);TSA与PAL具有弱正相关(相关系数0.35),与ICS具有强正相关(相关系数0.643)。FSA与黄芩苷存在显著性正相关(相关系数0.717,p<0.05),但与黄芩素存在弱负相关(相关系数-0.383);TSA与黄芩苷存在强正相关(相关系数0.683),与黄芩素存在显著性负相关(相关系数-0.59,p<0.05)。综合上述研究结果得到如下结论:1.黄芩中PAL和ICS均能调控SA合成,且PAL和ICS两条途径对SA合成的影响存在差异,其中PAL主要影响FSA合成,ICS主要影响TSA合成。2.黄芩FSA与PAL和ICS间存在正相关,TSA与PAL和ICS间也存在正相关关系;且FSA与PAL间的相关程度较ICS高,TSA与ICS间的相关程度较PAL高。3.PAL和ICS合成SA途径可能存在负反馈调节机制,SA参与或触发了该调节过程,以防止SA的过度累积对植株产生伤害,但其作用机制还有待深入研究。4.黄芩中SA能够显著影响黄芩苷和黄芩素的合成水平,且FSA和TSA对黄芩苷和黄芩素合成调控存在差异,其中FSA对黄芩苷的影响较TSA明显,TSA对黄芩素影响较FSA明显。5.SA与黄芩中黄芩苷黄芩素之间存在显著的相关性。FSA与TSA均与黄芩苷呈正相关关系,与黄芩素呈负相关关系;且FSA与黄芩苷间的相关程度较ICS高,TSA与黄芩素间的相关程度较PAL高。6.SA与黄芩苷黄芩素间存在相关关系,这可能是SA作为信号分子综合调节苯丙烷骨架和其它中间代谢原料的利用效率,以合成黄酮类物质,进而调控植株达到适合生理状态的需要。7.植物次生代谢调控网络存在重叠、交叉等现象,其调控机制复杂。影响药用植物次生代谢产物含量的因素众多,SA能够调控黄芩次生代谢产物的代谢流量,但SA对植物次生代谢调控的分子机制远未明确,其中PAL和ICS两条途径在SA合成过程中产生差异的原因,以及FSA和TSA调控黄芩苷和黄芩素累积水平的分子机理还有待进一步深入研究。本研究初步阐明了黄芩中PAL和ICS两条途径分别与FSA、TSA的关系,以及FSA和TSA分别与黄芩苷、黄芩素含量间的关系。为进一步研究SA在黄芩黄芩苷和黄芩素合成累积过程中的作用,调控黄芩药效物质代谢水平、提高其品质提供了一定理论支持。