深黄被孢霉 (Mortierella isabellina) 是毛霉目中具有重要经济价值的丝状真菌，可生产多种不饱和脂肪酸，特别是γ-亚麻酸(γ-linolenic acid，GLA)。作为人体必需的不饱和脂肪酸，GLA不仅参与生物膜的构成，而且是前列腺素、白三烯等活性物质的前体，因此在生物医药和食品领域有很大应用前景。在生物体内，△<6>-脂肪酸脱氢酶(△<6>-fatty acid desaturase，D6D)是γ-亚麻酸合成的关键酶。为了构建基因工程菌株，本实验室已从高产GLA的深黄被孢霉M6-22中克隆出△<6>-脂肪酸脱氢酶基因，并先后在酿酒酵母、烟草和大豆中获得表达。 近年的研究实践证明，通过化学诱变或基因敲除技术是筛选真菌脂肪酸脱氢酶基因缺失突变株、研究不饱和脂肪酸生物合成及其代谢调控的一条有效途径。但诱变育种具有一定的盲目性和随机性，而以DNA介导的真菌转化和DNA同源重组技术为基因缺失突变提供了有力的手段，因此丝状真菌遗传转化系统的开发成为近年来研究的热点。但由于遗传转化为稀有事件，其成功受到多方面因素的制约。主要的限制因素在于高效转化方法的建立和可用于转化子筛选的遗传标记的选择。 本研究利用亚硝基胍(MNNG)诱变方法筛选了一株深黄被孢霉潮霉素B敏感型菌株M6-22-4。采用PEG介导的方法，将含有 E.coli潮霉素B抗性标记的PD4质粒转入敏感株M6-22-4原生质体，并在潮霉素B浓度为400 μg/mL的选择培养基上筛选转化子，获得了1-2个转化子/μg质粒DNA的转化频率。稳定性试验表明，所获得的转化子在PDA培养基上传代6代以后，转接到选择平板上有5株仍具有HmB抗性；随机挑选了3个转化子，通过PCR方法检测到潮霉素抗性基因的存在，Southem杂交表明，潮霉素抗性基因以1-2个拷贝整合到深黄被孢霉M6-22-4染色体上，这是深黄被孢霉转化系统的首次报道。μ同时构建了含有潮霉素抗性基因表达单元和深黄被孢霉△<6>-脂肪酸脱氢酶基因5’与3’端部分同源序列的重组质粒pD4MI6，用于对深黄被孢霉△<6>-脂肪酸脱氢酶基因的敲除。通过基因枪法和原生质体-PEG/CaCl<,2>方法，将质粒pD4MI6转化深黄被孢霉M6-22-4菌株。转化子经潮霉素抗性选择平板筛选、PCR分子检测获得了一个△<6>-脂肪酸脱氢酶基因缺失的突变株Mut6。气相色谱分析结果显示：该突变株γ-亚麻酸特征峰消失，相应地亚油酸产量显著增加。培养结果表明该突变株的菌落形态、颜色及生长状况与出发菌株M6-22或M6-22-4相比均有显著改变。