随着社会经济的快速发展,大量的合成有机化合物被广泛生产和使用,主要涉及工业、农业和畜牧养殖业等各个领域。长江口具有独特的地理环境,为多种鱼、虾、蟹类繁殖及生长提供了良好的天然场所,是长江水系中华绒螯蟹的发源地和种源基地。但是,该地区人类活动高度密集导致该区域及邻近水域的生态环境遭到了破坏。因此,本论文选取长江口特色大型底栖动物中华绒螯蟹作为指示生物,选用红霉素、甲氧滴滴涕、氯化镉三种典型污染物作为目标化合物,通过水体暴露实验,监测不同时间各个污染物在中华绒螯蟹体内的积累含量,并通过组织形态学观察和检测关键代谢酶活性变化探究各个污染物的毒性效应。同时,本论文选取与红霉素性质不同的磺胺嘧啶作为代表物质联合暴露中华绒螯蟹,对比分析两种抗生素的生物积累情况及对关键代谢酶活性的影响,以探讨不同抗生素类污染物对中华绒螯蟹的毒性效应及作用机制。在此基础上,通过低浓度磺胺嘧啶暴露实验,研究了接近环境浓度下磺胺嘧啶的生态毒性效应。本研究为揭示水环境中不同污染物的复合生态毒性提供一定的理论依据,为生态环境中污染物的防控和风险评估提供有力的证据。主要研究结果如下:1.红霉素、甲氧滴滴涕和氯化镉三种典型污染物的复合生态毒性研究1.1红霉素、甲氧滴滴涕和氯化镉在中华绒螯蟹各组织中的生物积累效应基于超声萃取净化改进方法、加速溶剂萃取方法以及混合酸消解方法,对红霉素、甲氧滴滴涕和氯化镉(各1 mg/L)单独及联合暴露21天后中华绒螯蟹肝胰腺、鳃、肌肉和卵巢组织中污染物的积累情况进行分析。结果发现红霉素在鳃和肝胰腺组织中的残留含量较高,分别为3054 ng/g和392 ng/g;甲氧滴滴涕在鳃、卵巢和肝胰腺中的最高残留含量依次为294 ng/g、61 ng/g和35 ng/g;氯化镉在鳃和肝胰腺中的残留含量较高,分别为1154μg/g和461μg/g。同时,结合皮尔森相关系数分析发现,甲氧滴滴涕和氯化镉的存在可能促进中华绒螯蟹各组织对红霉素的积累;红霉素的存在可能促进肝胰腺和卵巢组织对甲氧滴滴涕的积累,氯化镉的存在可能促进肝胰腺、鳃和卵巢组织对甲氧滴滴涕的积累。结果表明,污染物浓度处于1 mg/L水平,在中华绒螯蟹体内有明显的积累现象,并且在积累过程中污染物之间可能存在相互作用关系。1.2红霉素、甲氧滴滴涕和氯化镉对中华绒螯蟹组织形态的影响基于各组织中污染物的积累现象,本论文进一步研究了不同污染物对中华绒螯蟹组织结构的影响。通过石蜡切片技术对红霉素和甲氧滴滴涕暴露后中华绒螯蟹组织形态进行观察,结果发现红霉素与甲氧滴滴涕暴露可导致肝小管结构损伤严重、大面积的空泡化结构、细胞核固缩和破碎等;鳃组织的鳃轴可见大量空泡、细胞结构破裂,甚至上皮细胞层解体及染色质外流;卵巢组织中卵细胞不规则、胞质密度减小等,并且随着暴露时间的延长组织损伤更严重。超微组织结构观察发现,氯化镉暴露后肝胰腺微绒毛结构变模糊、线粒体数量减少、基质出现空泡;鳃组织中微绒毛和底膜内折减少以至消失、线粒体肿胀双层膜破裂;卵组织细胞粘膜加厚、卵囊内膜与基质之间出现空隙;肌肉组织肌原纤维的排列间隙增大、线粒体体积膨胀甚至外膜崩解等。此研究表明,当红霉素、甲氧滴滴涕和氯化镉环境残留浓度处于1 mg/L水平,对生活于环境中的大型底栖动物组织损伤是极其严重的,甚至可能导致组织功能丧失。1.3红霉素、甲氧滴滴涕与氯化镉对中华绒螯蟹肝胰腺和鳃组织中关键代谢酶活性的影响为深入了解污染物对中华绒螯蟹细胞水平的影响并探究可能的毒性作用机制,本研究对污染物暴露后肝胰腺和鳃组织中四种关键酶的活性进行分析,包括乙酰胆碱酯酶(ACHE)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)、金属硫蛋白(MT)和超氧化物歧化酶(SOD),并结合肝胰腺和鳃组织中污染物的残留情况进行相关性分析。结果发现红霉素、甲氧滴滴涕和氯化镉对中华绒螯蟹肝胰腺和鳃组织中ACHE、GST和SOD的代谢水平均产生明显的影响,但不同污染物对代谢活动的影响不同。其中,肝胰腺中红霉素残留含量与ACHE存在显著相关性(P<0.05),并随着肝胰腺中红霉素的积累ACHE活性显著提高;肝胰腺和鳃组织中甲氧滴滴涕的残留含量与GST的活性变化存在明显的负相关性(P<0.05),甲氧滴滴涕的残留可能抑制GST的活性;而随着镉的积累肝胰腺中GST的活性被降低,鳃组织中ACHE的活性则逐渐提高。因此,肝胰腺中ACHE的水平可作为红霉素毒性标志物,鳃中ACHE的活性可作为氯化镉的毒性标志物,肝胰腺和鳃中GST的水平甲氧滴滴涕和氯化镉的毒性标志物,为环境中污染物的风险评价提供理论基础。2.代表性抗生素红霉素和磺胺嘧啶对中华绒螯蟹的联合毒性研究2.1红霉素和磺胺嘧啶在中华绒螯蟹各组织中的生物积累效应红霉素作为环境中常见抗生素类污染物并且检测频率较高,本研究发现其具有明显的生物积累效应和毒性效应。因此,为进一步了解抗生素类药物的生态毒性,本研究选取与红霉素性质完全不同的磺胺嘧啶作为代表污染物,通过单独及联合暴露(各1 mg/L)21天后,分析各个组织中污染物的积累含量。结果发现各个组织中红霉素和磺胺嘧啶残留的最高含量均出现在联合暴露组,而且四个组织中红霉素最高残留含量从高到低依次为鳃(867 ng/g)、肝胰腺(116 ng/g)、肌肉(13 ng/g)和卵巢(13 ng/g);磺胺嘧啶最高残留含量从高到低依次为鳃(478ng/g)、卵巢(160 ng/g)、肝胰腺(158 ng/g)和肌肉(43 ng/g)。结合皮尔森相关性分析,发现红霉素可能促进鳃和卵巢组织对磺胺嘧啶的积累,而肝胰腺组织中红霉素与磺胺嘧啶在积累过程中可能存在竞争作用;磺胺嘧啶则促进卵巢组织对红霉素的生物累积效应。此结果说明,红霉素与磺胺嘧啶在中华绒螯蟹体内均有积累。2.2磺胺嘧啶和红霉素联合暴露对肝胰腺和鳃组织中关键酶活性的影响为进一步分析磺胺嘧啶和红霉素对中华绒螯蟹关键代谢酶活性的影响,本研究对肝胰腺和鳃组织中ACHE、GST和SOD的活性进行测定,结果发现磺胺嘧啶和红霉素单独及联合暴露后,均对中华绒螯蟹肝胰腺和鳃组织中ACHE、GST和SOD的活性造成影响。因而推断,磺胺嘧啶和红霉素联合暴露对肝胰腺和鳃组织中ACHE、GST和SOD的代谢水平均产生了毒性效应。同时,结合肝胰腺和鳃组织中磺胺嘧啶及红霉素的残留含量进行相关性分析,发现磺胺嘧啶残留含量与中华绒螯蟹肝胰腺中的ACHE和GST的活性以及鳃组织中GST的活性显著相关(P<0.05),表明磺胺嘧啶暴露对肝胰腺中ACHE、肝胰腺和鳃组织中GST相关的代谢活动产生毒性效应,推断磺胺嘧啶通过影响代谢通路进而引起中华绒螯蟹肝胰腺的代谢失衡,ACHE和GST可作为磺胺嘧啶作用于中华绒螯蟹的潜在毒性标志物。3.低浓度磺胺嘧啶对中华绒螯蟹的生物毒性及作用机理研究3.1低浓度磺胺嘧啶在中华绒螯蟹体内的分布及含量基于抗生素在中华绒螯蟹组织中的积累,且磺胺嘧啶具有较强的亲水性,更容易随着水体迁移,因此本论文通过低浓度磺胺嘧啶(50 ng/L、100 ng/L、500 ng/L和1000 ng/L)暴露中华绒螯蟹44天后,对中华绒螯蟹各组织中磺胺嘧啶的生物积累效应和关键代谢酶进行了研究,结果发现:处于暴露浓度数量级不同的暴露组内,肝胰腺、鳃和肌肉组织中磺胺嘧啶的残留含量均低于3 ng/g。尽管磺胺嘧啶通过水体进入生物体内的可能性较高,且水体环境中磺胺嘧啶的残留水平处于1μg/L时,磺胺嘧啶在中华绒螯蟹体内呈现有限的生物累积效应。3.2低浓度磺胺嘧啶暴露对中华绒螯蟹鳃组织关键代谢酶的影响不同浓度磺胺嘧啶暴露后,鳃组织中三种关键代谢酶ACHE,碱性磷酸酶(AKP)和SOD的活性均有发生明显变化;同时结合鳃组织中磺胺嘧啶的残留含量进行相关性分析,结果发现在50 ng/L和1000 ng/L暴露组,鳃组织内磺胺嘧啶的残留含量均与ACHE的活性变化呈现显著的负相关性(P<0.05);仅100ng/L组磺胺嘧啶的残留含量与AKP的活性呈现极显著的负相关性(P<0.01)。因此,结合前期研究结果发现,ACHE、GST和AKP可以作为磺胺嘧啶作用于中华绒螯蟹的毒性标志物,可以用来显示暴露于磺胺嘧啶下中华绒螯蟹的生活状态。本研究通过研究红霉素和磺胺嘧啶、甲氧滴滴涕和氯化镉对中华绒螯蟹的生态毒性及潜在作用机理,发现当污染物浓度为1 mg/L水平时,对水环境中的生物有明显的生物积累现象;并对中华绒螯蟹的组织结构和代谢酶活性造成明显的影响。由此可推断污染物的生物积累可能通过食物链传递进入高营养级生物体内,进而导致污染物富集现象,并可能威胁人类生命健康。同时,由于实际环境中多种多样污染物同时存在,在生物积累过程和毒性作用中可能存在相互作用,进而导致污染物的生态毒性被放大,对整个生态系统可能产生更严重的危害。因此,本论文在生物积累、生物毒性和生物标志物三个层面研究了水体中典型污染物对中华绒螯蟹的影响,分析了污染物在毒性效应中可能存在的相互作用,为水产养殖过程中药物用量的控制、实际环境中污染物排放量的控制以及评价水体环境中污染物的环境风险提供有力的证据。