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双分子荧光互补(Bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC)具体是指将两个不具备荧光效应的荧光蛋白的互补片段分别和具有相互作用的蛋白形成融合蛋白并在细胞内共表达后重新形成荧光的现象。当某些特定的荧光分子片段作为分子标记分别与两个能够发生相互作用的蛋白质形成融合蛋白并在细胞内一起表达时,具有相互作用的两个蛋白的结合会使得这两个荧光片段重新组合形成荧光复合体并且恢复荧光效应。该技术通常被用来研究蛋白质间的相互作用。本论文将用此方法验证具有特异性识别的蛋白质是否与目标核酸链相结合。PUF家族蛋白是一类高度保守的RNA结合蛋白,存在于大多数的真核生物中。PUF蛋白通过与目标RNA的3’非翻译区的特异性序列相结合来调节mRNA的表达水平。所有PUF蛋白都含有特定的序列,即RNA结合域,也称为PUF蛋白域。PUF蛋白域对RNA碱基识别具有特异性,如半胱氨酸、谷氨酰胺与腺嘌呤相识别,天冬酿胺、谷氨酰胺与尿嘧啶相识别,丝氨酸和谷氨酸盐与鸟嘌呤相识别,丝氨酸和精氨酸识别胞嘧啶。人类PUF蛋白PUM1与对应RNA复合体的晶体结构证明特定的PUF螺旋识别特定的碱基,这样简洁的识别模式暗示了PUM1的识别序列可被定点诱变。而已有的实验结果表明,这些被定点诱变的PUF蛋白可以识别胞嘧啶并且和原始蛋白同样紧密的结合于RNA上。首先我们构建了 CEYFP-PUF1和PUF2-NYFP两个融合蛋白表达载体分别在大肠杆菌中进行表达纯化。我们成功构建了体外BiFC体系,明确了两个蛋白能够结合到含有识别序列的同一核酸链并且对两个蛋白识别位点之间的间距有了初步的研究。该结果表明,特别设计的PUF蛋白能够在体外准确地识别其特定的核酸序列。其次,我们在模式植物拟南芥中选定GUS基因为目标,设计了相应的PUF蛋白,实验结果表明,实验组GUS基因的表达量下降到了对照组的0.1%以下。有趣的是,其他含有该PUF蛋白识别序列的拟南芥内源基因的表达量并不受PUF蛋白的影响。然而,在哺乳动物细胞内,PUF并没有对HBZ基因的表达产生影响。这可能表明在不同的生物内PUF对基因的调节机制并不一致