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阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种神经退行性疾病,病理特征主要包括:β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)沉积形成的细胞外斑块;Tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结;神经元退化伴星型胶质细胞激活等。在AD致病机理的假说中,淀粉样蛋白级联假说是迄今为止最为流行的假说。该假说认为,β位点APP裂解酶1(β-site APP cleaving enzyme 1,BACE1),也称为β分泌酶,启动淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)的切割和Aβ的产生,最终导致神经元变性,是AD发病机制中的关键步骤。因此研究BACE1动态变化及其活性调控十分重要。利用BACE1在酸性pH下具有最大活性这一特点,我们构建了一个基于双荧光的BACE1报告质粒,将BACE1的活性可视化,能够动态指示培养细胞中或体内的活性/非活性的BACE1蛋白。GFP和GFP突变体pHluorin的荧光强度具有pH依赖性,在酸性(pH=4.5-6)条件下不发出荧光,在中性或偏碱性(pH=7-7.5)条件下发出绿色荧光;mCherry的荧光强度不具有pH依赖性,细胞内囊泡pH值的变化并不改变红色荧光的荧光强度,能够指示融合蛋白的表达和亚细胞定位。根据这些特点,我们构建了三种BACE1双荧光报告质粒,分别命名为囊泡端pH敏感的BACE1(pHluorin-BACE1-mCherry)、胞质端pH敏感的BACE1(BACE1-mCherry-pHluorin)和对照组pH敏感的BACE1(BACE1-mCherryEGFP),进一步研究了这些载体在不同pH条件下的表达特征。通过对比三种BACE1融合蛋白对氯喹(chloroquine,CQ)或巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1,BafA1)处理后荧光特性的改变,我们发现囊泡端pH敏感的BACE1能够迅速、敏感的响应CQ或BafA1介导的pH变化,能够通过荧光强度的变化体现BACE1蛋白(β分泌酶)活性的变化,同时可以响应BACE1抑制剂LY2886721的作用。(前)肾素受体((pro)renin receptor,PRR)作为空泡型ATP酶(V-ATPase)复合物的一个亚基,也被鉴定为氢离子转运ATP酶溶酶体辅助蛋白2(ATPase H+transporting lysosomal accessory protein 2,ATP6AP2),对维持细胞内囊泡的pH至关重要。我们发现囊泡端pH敏感的BACE1能够敏感的响应PRR基因敲除和功能恢复时BACE1蛋白的活性变化。最后,我们发现囊泡端pH敏感的BACE1可以在体内外指示神经元中BACE1对APP瑞典突变(Swedish mutant APP,APPswe)的切割活性,暗示APPswe不仅可以作为BACE1的底物,还可以作为BACE1的激活剂。总之这些结果表明,囊泡端pH敏感的BACE1(pHluorin-BACE1-mCherry)可以作为一个有用的工具,在体外和体内观察活性/非活性状态下的BACE1。本研究中建立的体外和体内的分析和评价模型,是一种简单快速且经济的手段,可以用于以BACE1为靶点的抑制剂的筛选,对于AD治疗药物的研发具有重要的意义。