金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，金葡菌)是一种自然界中广泛存在的革兰阳性菌，属于葡萄球菌属（Staphylococcus），其广泛分布于自然界，是一种重要的致病菌，能够引起多种疾病，如局部化脓感染、肺炎、伪膜性肠炎、中毒性休克、心包炎等，甚至会引起脓毒症、败血症等全身性感染，此外还可引起尿路感染、骨髓炎等疾病；同时，金葡菌也是造成人类食物中毒的常见致病菌之一。金葡菌主要通过产生多种毒力因子参与相关疾病的发生发展过程，这些致病因子包括溶血素、杀白细胞素、肠毒素、凝固酶和耐热核酸酶等。　　溶血素(hemolysins)，又称细胞溶素（cytotoxin），是指细菌分泌的能够使细胞溶解的毒素，是金葡菌产生的一种重要毒力因子。溶血素不仅能裂解红细胞，同时还对其它多种类型的细胞具有损害作用，如：单核细胞、血小板、成纤维细胞、心肌细胞、粒细胞和内皮细胞等，因此，溶血素是公认的可使细菌产生致病力的毒力因子。金葡菌产生的溶血素包括α、β、γ、δ四种。其中α、γ、δ又被称作打孔毒素（pore-forming toxin PFT），即能跨细胞膜形成孔道，允许小分子和离子通过，从而使靶细胞代谢紊乱，最终裂解细胞。而β-溶血素（β-hemolysins Hlb）作用机制与前三种均不同，因此被称之为非打孔毒素。β-溶血素属于酶类溶血素，它通过水解靶细胞膜上的脂质双分子层中的磷脂而使细胞膜破裂。Aarestrup等研究证实，与从人类分离获得的金葡菌菌株相比，来源于牛的大部分菌株携带有β-溶血素基因和表达该基因表型。金葡菌的β-溶血素能够损伤奶牛乳房上皮细胞，增加金葡菌对奶牛乳腺上皮细胞的粘附以及促进金葡菌增殖，因此也是引发奶牛乳房炎的主要致病因子之一。　　β-溶血素基因全长993bp，编码330个氨基酸，其1-34aa为信号其信号肽，相对分子质量为35kDa。其在金葡菌中高度保守，金葡菌NCTC-8325菌株中，其编码基因为SAOUHSC_00561。目前国内外对Hlb的研究很少，已有研究表明， Hlb是一种鞘磷脂酶C，并能特异性水解鞘磷脂，在Mg2+的存在的条件下，其生物活性能够显著增强。而且，Hlb在体外具有独特的溶血活性：Hot-cold溶血特性，即Hlb在37℃作用于红细胞，红细胞不裂解，随后置于4℃红细胞则能够裂解，但其作用机制尚不明确。晶体结构表明，Hlb的第149位和287位的组氨酸（H）是其发挥生物学活性的关键性位点，将149或287位的组氨酸（H）突变为天冬酰胺（N）时，Hlb不再具有溶血活性。此外，Medora J.等人还发现Hlb具有结合核酸的活性。　　中性粒细胞(Neutrophils)是血液中数目最多的白细胞，也是机体防御病原体入侵的重要细胞，在机体固有免疫应答中起着重要作用，在机体免疫反应中主要通过吞噬和脱颗粒作用抵御病原微生物的入侵。近年来已有研究发现一种新的中性粒细胞防御手段，介于凋亡和坏死之间的细胞程序性死亡方式——形成中性粒细胞胞外诱捕网络（Neutrophil Extracellular Traps NETs），即网捕死亡(NETosis)。中性粒细胞在微生物或化学刺激下，借助于活性氧类物质，细胞核染色质解聚成网状结构并释放到胞外，并伴有胞质蛋白和颗粒蛋白镶嵌其中，从而可通过其网状结构捕获并杀灭细菌、真菌和寄生虫等，抵御入侵病原体在机体内播散。　　NETs是由中性粒细胞释放到胞外的网状结构，其主要成分有：DNA、组蛋白（Histone）、髓过氧化物酶（MPOS）、中性粒细胞弹性蛋白酶（Neutrophil Elastase NE）、组织蛋白酶G，现已经在多种脊椎动物（包括斑马鱼、家禽、小鼠和人）中发现NETs结构的存在。NETs可清除多种微生物，包括寄生虫、革兰氏阳性和革兰氏阴性菌和真菌，如原生寄生虫亚马逊利什曼原虫、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、志贺氏菌、烟曲霉和白色念球菌。　　HL-60是人早幼粒细胞白血病细胞系，经诱导后，该种细胞在化学激活和趋化性方面均表现出和中性粒细胞诸多一致特性，故被称做类中性粒细胞(neutronphil-like cells)。另外，由于它与中性粒细胞在化学激活、细胞形态和趋化性等方面均表现出诸多的一致性，但是却又不会像中性粒细胞一样自发性凋亡，故常被用作研究中性粒细胞的替代细胞模型。　　在本研究中，我们对金葡菌中Hlb蛋白的功能进行了深入研究，主要研究结果包括以下三部分：　　第一部分：金葡菌Hlb及其突变体HlbH-149-N蛋白的表达及功能初步研究　　1．Hlb及其突变体HlbH-149-N蛋白的表达：通过构建Hlb及其突变体HlbH-149-N蛋白的重组表达载体，利用大肠杆菌原核表达系统重组表达Hlb及其突变体HlbH-149-N 蛋白，通过Ni2+柱螯合纯化得到Hlb及其突变体HlbH-149-N蛋白。　　2．Hlb蛋白功能的初步研究：金葡菌通过分泌多种细胞外蛋白，直接产生细胞毒性或者通过与宿主的免疫分子相互作用从而逃避宿主的免疫监控，维持其在宿主中的存活并引发感染。我们首先通过红细胞裂解实验检测Hlb及其突变体HlbH-149-N蛋白的溶血活性，结果发现Hlb蛋白能够显著裂解绵羊红细胞，而HlbH-149-N蛋白则没有这种作用。利用透射电镜进一步证实Hlb具有裂解绵羊红细胞的作用。进一步研究现Hlb对不同种属红细胞的裂解作用存在差异。同时，利用重组Hlb蛋白免疫大耳白兔制备了抗Hlb多克隆抗体(Anti-Hlb)，并通过ELISA与Western blotting实验证实Anti-Hlb能够特异性地与Hlb结合，更重要的的是，我们证实Anti-Hlb可以有效抑制Hlb对绵羊红细胞的裂解作用。　　第二部分：Hlb与NETs(Neutrophil extracellular traps)的相互作用　　中性粒细胞是机体抵抗病原体入侵的关键细胞，在机体固有免疫应答中起着重要的作用，主要通过吞噬和脱颗粒作用抵御病原微生物的入侵。中性粒细胞在微生物或化学刺激下能够形成中性粒细胞胞外诱捕网络（Neutrophil Extracellular Traps NETs），由DNA、组蛋白（Histone）、中性粒细胞弹性蛋白酶（Neutrophil Elastase NE）、髓过氧化物酶（MPOS）、组织蛋白酶G组成，现已经在多种脊椎动物（包括斑马鱼、家禽、小鼠和人）中发现NETs结构的存在。凝胶阻滞（Electro Mobility Shift Assay EMSA）实验证明Hlb能够与DNA结合，而DNA又是NETs的骨架结构，由此提示我们Hlb可能与NETs有关。利用激光扫描共聚焦显微镜,我们成功检测到Hlb与NETs的结合，并且Hlb能够抑制NETs介导的中性粒细胞对细菌的杀伤作用，提示Hlb可能参与了金葡菌的宿主免疫逃逸过程。　　第三部分：Hlb对T细胞的杀伤作用　　淋巴细胞是组成机体免疫应答功能的重要细胞成分，可分为NK细胞、B细胞和T细胞等亚类，分别介导机体的对肿瘤细胞和病毒感染细胞的杀伤作用、体液免疫和细胞免疫等。细胞免疫在免疫系统中具有重要的作用，而在细胞免疫中T淋巴细胞起着关键作用，同时在体液免疫中T淋巴细胞还起着递呈抗原的作用。利用流式细胞术检测Hlb蛋白对人外周血单个核细胞(PBMC)的影响，发现Hlb对单核细胞和淋巴细胞具有杀伤作用，进一步分析发现， Hlb主要作用于T淋巴细胞，而B淋巴细胞对Hlb的杀伤并不敏感。并且Hlb对Jurkat细胞(T细胞白血病细胞系)也表现出一定的杀伤作用，且Mg2+的存在能够促进其杀伤作用。通过流式细胞术检测到Hlb在Mg2+存在的条件下能够特异性结合Jurkat细胞，而在Mg2+缺乏的条件下则不结合，提示我们Hlb对Jurkat细胞的结合可能是Jurkat细胞膜表面分子介导的作用。通过Pull down实验在Mg2+存在的条件下成功钓取到Jurkat细胞膜蛋白中与Hlb结合的蛋白。我们将在后续工作中，通过质谱分析，寻找潜在的作用分子，从而进一步的研究Hlb对T细胞杀伤的具体作用机制。