糖尿病足(diabetic foot，DF)是糖尿病重要的慢性并发症之一，且糖尿病足溃疡是导致糖尿病患者下肢截肢的重要原因。减压鞋、抗生素和敷料的使用、外科清创术以及正确的护理常为治疗糖尿病足溃疡所必需；其中敷料可防止伤口进一步受损，减少感染的危险，保持伤口愈合的理想环境，已越来越多地用于糖尿病足溃疡的创面处理。近年来各种新型敷料的研制也成为研究的热点。一般来说，新型敷料是指那些在外形上有别于传统敷料(纱布)，同时在功能上又能主动参与并影响创面愈合速度与质量的一类用于创面覆盖的物质。目前应用在糖尿病难愈创面上并取得较好疗效的新型敷料主要有水凝胶敷料、水胶体敷料、藻酸盐敷料、合成敷料、Biobrane、Dermagraft等。 水凝胶敷料是一类性能优于传统敷料和生物敷料的新型生物材料，在生物医学工程领域有广泛的研究和应用。通过维持有利于伤口愈合的湿润环境，水凝胶敷料可以帮助清除坏死组织，防止水分和体液的过度散失，且其不会同创面粘连，保护换药时伤口不受二次损伤，从而提高病人的接受度。同时由于水凝胶透明度高，医生可透过其随时观察伤口变化情况。此外，还可根据需要，将不同药物包埋在水凝胶内，药物可持续地释放到病变区，从而达到治愈伤口和其他皮肤病的目的。致力于具有优良性能医用水凝胶敷料的研制，中山大学高分子研究所以海藻酸钠和聚乙烯醇两种生物相容性良好的高分子材料为主要原料，采用原位交联技术制备和表征了一类新型水凝胶敷料基质。 1．通过大鼠经皮急性毒性试验、皮肤刺激试验和皮肤致敏反应试验对新型水凝胶敷料基质的安全性进行初步评价。 2．评价新型水凝胶敷料基质对大鼠伤口愈合的有效性。 材料与方法 1．大鼠经皮肤急性毒性试验选成年、健康、皮肤无损伤的体重约为200-300gSD大鼠20只，将20只大鼠随机分成2组，每组10只，雌雄各半。1组为高剂量组，给水凝胶敷料基质。2组为空白对照组，不给与任何药物。给水凝胶敷料基质前24小时用机械法将两组大鼠背部脱毛，脱毛范围约20cm<2>。染毒途径为脱毛24小时后取水凝胶敷料基质5g/kg均匀涂于高剂量组大鼠背部脱毛区，然后用纱布及保鲜膜覆盖，再用无刺激性胶布及绷带加以固定。空白对照组不涂抹，作为空白对照。24小时后用温水或无刺激溶剂去除残留水凝胶敷料基质，每日观察，连续7-14天。给药后详细记录动物全身中毒表现和死亡情况，包括动物体重、皮肤、毛发、眼睛和粘膜的变化。呼吸、循环、中枢神经系统、四肢活动等变化。遇有死亡动物进行尸检和肉眼观察，当有肉眼可见病变时，进行病理检查。试验结束后即时对各组大鼠进行血常规、血生化检查，并将全部大鼠处死取心、肝、肾组织进行病理检查。 2．大鼠皮肤刺激试验选成年、健康、皮肤无损伤的体重约为200-300gSD大鼠30只，将30只大鼠随机分成完整皮肤组、破损皮肤组和对照组，每组各10只，雌雄各半。试验前24小时将其背部脊柱两侧用机械法脱毛，脱毛范围约20cm<2>。破损皮肤的制作是用注射针头在脱毛区皮肤消毒后划破，以有渗血为度。脱毛24小时后取水凝胶敷料基质0.5g均匀涂在两个试验组大鼠背部脱毛区，然后用纱布及保鲜膜覆盖，再用无刺激性胶布及绷带加以固定。对照组不涂抹，作为空白对照。24小时后用温水或无刺激溶剂去除残留水凝胶敷料基质，即刻观察，然后于1h、24h、48h、72h后再次观察给水凝胶敷料基质部位刺激反应情况。每日观察，连续7-14天。 3．大鼠皮肤致敏反应试验选成年、健康、皮肤无损伤的体重约为200-300gSD大鼠20只，将20只大鼠随机分成2组，每组10只，雌雄各半。第一组为试验组，给水凝胶敷料基质，第二组为空白对照组，不给与任何药物。 ①致敏接触：于试验前24小时将试验组大鼠背部两侧用机械法脱毛，脱毛范围约3cmx3cm。取水凝胶敷料基质0.1 g涂在动物右侧脱毛区，用纱布及保鲜膜覆盖，再用无刺激性胶布固定，持续6小时。第七天和第十四天，以同样方法重复一次。 ②激发接触：于末次致敏后14天，将水凝胶敷料基质0.1g涂于试验组大鼠背部左侧脱毛区，6h后去掉受试物，即刻观察，然后于24h、48h、72h再次观察皮肤过敏反应情况． 4．伤口面积愈合率评价将250克左右清洁级雄性SD大鼠随机分为正常大鼠组(N)和糖尿病大鼠组(D)，通过腹腔注射STZ使糖尿病大鼠组的大鼠均发生糖尿病。将N组随机分为N1组和N2组，D组随机分为D1组和D2组。每小组10只大鼠。N组和D组成模6w后，以边长为1.3cm的消毒模板作为标志用手术刀在鼠背部正中距离颅骨后1cm处形成一个1.3×1.3em的正方形伤口，切除范围深达筋膜，伤口形成后每个鼠单笼饲养。N1组和D1组伤后于伤口处连续涂抹水凝胶敷料基质7天，N2和D2组则不抹。于伤后0天、3天、6天、9天、16天和20天用数码相机在固定的距离内进行拍摄，同时放置一个有刻度直尺并标明大鼠的号码和照像日期。伤口面积用Image J(1．0．3版本)进行计算，用鼠标描出伤口边缘然后计算面积。每次测量重复2次，取其平均数。根据以下公式计算伤口面积愈合的百分率，愈合率=(伤口面积(0d)-伤口面积(nd))/伤口面积(0d)×100％。 5．组织学评分的实验动物分组及标本采集。 将250克左右清洁级雄性SD大鼠随机分为正常大鼠组(N)和糖尿病大鼠组(D)，通过腹腔注射STZ使糖尿病大鼠组的大鼠均发生糖尿病。将N组随机分为N1和N2两组，并将N1和N2各分为4个小组，分别为Ndo(造伤口当天)、Nd<,3>(伤口形成后第3天)、Nd<,7>(伤口形成后第7天)、Nd<,14>(伤口形成后第14天)，每小组8只大鼠；D组也随机分为D1和D2两组，并将D1和D2各分为4个小组，分别为Dd<,0>(造伤口当天)、Dd<,3>(伤口形成后第3天)、Dd<,7>(伤口形成后第7天)、Dd<,14>(伤口形成后第14天)，每小组8只大鼠。正常大鼠和糖尿病大鼠成模6w后，以边长为1.3cm的消毒模板作为标志用手术刀在鼠背部正中距离颅骨后1cm处形成一个1.3×1.3cm的正方形伤口，切除范围深达筋膜，伤口形成后每个鼠单笼饲养。Nl和D1两组在伤后于伤口处连续涂抹水凝胶敷料基质7天。N2和D2两组则不涂抹。伤后0天、3天、7天、14天切除整个伤口(包括伤口周围的5mm内的正常皮肤)直至筋膜，标本固定于4％的多聚甲醛溶液中，用于组织学检查。 6．皮肤组织HE(Haematoxylin and eosin)染色组织取材后，经4％的多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，行与头尾轴和皮肤表面垂直厚度4 μm切片，切片经二甲苯脱蜡，然后进行浓度下行的梯度酒精直至蒸馏水。苏木素-伊红染色，自来水冲洗。常规脱水，二甲苯透明，中性树脂封固。 7．Masson三色染色法(Masson Trichrome Staining)评价胶原纤维含量石蜡切片常规脱腊至水，滴加Masson复合染色液后蒸馏水冲掉染液，加入磷钼酸染色后滴加苯胺蓝蒸馏水稍冲，即滴加分化液分化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封固。 8．组织学评分组织切片HE染色后，显微镜下观察以下指标：表皮和真皮的再生、肉芽组织厚度、新生血管形成，联合Masson染色结果由一位病理科医生独立进行组织学评分。 9．统计学分析采用SPSS12.0统计学软件进行分析。实验数据符合正态分布者用均数±标准差表示，正态数据两组间比较采用students t检验。经正态性检验，两组间多个时间点数据的比较采用多元方差分析，α值定为0.05。 结论 1．新型水凝胶敷料基质对大鼠机体无急性毒性影响，对大鼠皮肤无刺激和致敏作用，可初步证明其具有一定的动物安全性。 2．新型水凝胶敷料基质可提高糖尿病大鼠的伤口面积愈合率，并对正常大鼠和糖尿病大鼠伤口愈合的组织病理学过程有一定的积极作用。