椎间盘退行性变(Intervertebral Disc Degeneration, DDD)是现代社会影响人类生活质量的主要病症之一。椎间盘主要由外部纤维环(Annulus Fibrosus, AF)及中央部髓核(Nucleus Pulposus, NP)组成,是连接相邻两个椎体的纤维软骨盘,是一种粘弹性的固体材料,具有蠕变,松弛,滞后等特性。成人共有23个椎间盘,支撑人体上半身重量的同时吸收震荡能量,并起到保护其中的中枢神经的作用。髓核细胞在维持椎间盘正常生理功能中起重要作用。随着个体发育(Aging Process),髓核细胞的组成在不同阶段经历复杂的变化;其中的脊索细胞逐渐消失,软骨状细胞逐渐增加。研究表明这种细胞组成的转变,在椎间盘退行性变过程中有重要影响。由脊索细胞分泌的蛋白多糖与胶原组成的网络可以形成肿胀压以抵抗压缩应力。生理状态下线性的多聚糖链富含硫酸盐与糖醛酸离子而呈负电性;当髓核受到外力挤压时,水分大量渗出,离子浓度升高,引起渗透压升高,不可压缩的蛋白多糖与胶原构成的固体线性网络发生应变以抵抗压缩应力;当外力消失时,高渗透压将髓核组织周围的水分重新吸收回来。椎间盘退行性变过程中,伴随髓核中蛋白多糖、水分和Ⅱ型胶原减少;以及Ⅰ型和Ⅲ型胶原、组织纤维化和硬度增加等现象。维持髓核细胞中蛋白多糖、胶原及水含量的稳定对椎间盘的功能稳定和发挥具有重要作用。大量研究表明力学环境对髓核细胞有重要影响,并且是引起椎间盘退行性变的一个重要因素之一。力学刺激对髓核细胞的影响包括其细胞组成、细胞外基质的分泌、含水量等。脊椎的主要功能是为躯干提供力学支撑,并且为躯干的各种运动提供条件。日常生活中,由于人体不同的姿势,致使椎间盘受到力学刺激方式较复杂,通常是压缩、弯曲和扭转的组合,但其中压缩应力是最主要的。髓核在承受压缩应力时,髓核部位产生静水压,通过静水压将压缩应力均匀地传递到周围的纤维环,避免椎间盘的某一部位因过度承载而发生损伤,具有平衡压缩应力的作用。髓核组织产生静水压对纤维环的张力,根据力的相互原理,纤维环同时对髓核组织产生一定的挤压应力。所以髓核在体内受压应力时不仅受到轴向的压力,纵向上还同时受到一定程度上纤维环的挤压,即一定程度限制性压应力加载。由于纤维环的弹性、渗透性等特征及纤维环组织本身在不同个体、不同健康状态之间有不同的几何结构,使这种限制性应力加载比较复杂,称不上是严格意义的限制性加载,而是伴有一定程度的非限制性压应力加载。迄今为止,关于这两种力学模型对髓核细胞表达及分泌细胞外基质的影响尚未见报道。为了研究这两种力学模型(限制性与非限制性)对髓核细胞的影响,本文研究中我们用大鼠的髓核细胞对其施加周期性应力和静态应变力学刺激,以研究这两种力学模型对髓核细胞表达蛋白多糖的影响。我们的主要研究工作和结果如下:①限制性和非限制性力学模型对髓核细胞表达蛋白多糖的影响从大鼠尾部原代培养获取髓核细胞,并将其种入藻酸盐凝胶中进行3D培养,24小时候后,分别施加周期性10 kPa的机械压应力和20%的静态应变。收集细胞样品后,经Real time PCR检测蛋白多糖基因表达。实验结果表明,与无应力对照组相比,周期性动态应力加载使Glypican、Biglycan、Fibromodulin基因表达都呈上调趋势,Aggrecan、Laminin以及Fibronectin基因表达保持不变;而Lumican基因表达的上调只发生在非限制性力学模型中。而静态应变加载中,Lumican基因表达在非限制性模型中呈下降趋势,相反在限制性模型中基因表达上调;其他基因表达在20%的应变下都得到增强。为了解释这一现象,我们猜测Lumican基因表达可能与细胞、细胞核形变存在一定关联。为了证实这一假设,将髓核细胞接种在藻酸盐凝胶中进行3D培养,经荧光染料染色后分别通过限制性与非限制性模型对藻酸盐凝胶施加20%应变,荧光显微镜下观察细胞、细胞核形变,并通过Image J软件分析。结果表明无论是周期性应力加载还是静态应变加载,非限制性模型中髓核细胞、细胞核都发生较大形变,这一结果无法解释Lumican基因表达在周期性应力与静态应变试验中呈相反趋势这一现象,这与我们的预先假设不符;②线性双相模型对藻酸盐凝胶内压强的计算为了进一步探求引起Lumican基因表达上调的可能因素,我们利用双相线性数学模型对限制性加载模型中藻酸盐凝胶内部各位点的应变和压强分布进行分析。模型中,假设藻酸盐凝胶主要由理想流体(主要是水)和不可压缩的凝胶基质两部分组成。计算结果表明在限制性力学模型中,20%的应变下,藻酸盐凝胶内部持续存在压强差,即藻酸盐凝胶内部持续存在一定的剪切力。③流体剪切应力上调Lumican基因、蛋白表达为了验证流体剪切力是否可以引起Lumican表达上调,将原代培养获得的大鼠髓核细胞接种在涂有Matrigel的载玻片上,然后通过流动腔对其施加不同大小(0.4dyn/cm2、1dyn/cm2)的流体剪切力,收获细胞RNA,经Real time PCR和Western Blot实验分别检测Lumican基因和蛋白表达。实验结果表明,1dyn/cm2的流体剪切力上调Lumican基因及蛋白表达。据我们所了解,这是第一次报道流体剪切力能引起髓核细胞中Lumican表达变化。④流体剪切应力激活髓核细胞ERK磷酸化并引起细胞骨架重排为了进一步研究流体剪切力对髓核细胞的影响,我们结合相关文献,发现流体剪切力可以激活髓核细胞中MAPK家族中ERK的磷酸化,通过进一步实验发现这一过程和Actin蛋白骨架密切相关,流体剪切应力可以引起Cytokeratin 8细胞骨架的重排。综上所述,本文用藻酸盐凝胶对髓核细胞3D培养,并且通过限制性和非限制性力学模型对其施加动态和静态力学刺激,以检测不同力学加载方式对髓核细胞的影响,发现不同力学加载方式引起蛋白多糖Lumcian基因表达呈不同趋势。进一步通过双相线性数学模型计算,发现在静态应变加载中,藻酸盐凝胶在限制性加载过程中存在持续的流体剪切力,推测正是这种内部流体剪切应力参与了髓核细胞调节Lumican表达的变化。经过进一步实验证实了这一假设并且发现髓核细胞在流体剪切力作用下通过激活ERK磷酸化和蛋白骨架的改变,以响应外部力学信号的刺激。