真菌多糖是一大类的重要大分子物质，从20世纪70年代开始发现香菇多糖Lentinan的抗肿瘤活性以来，越来越多的生物活性被发现，包括抗肿瘤、免疫调节、抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗氧化等。近年来许多研究发现，真菌多糖口服后也依然能发挥生物活性。然而，真菌多糖口服后是如何发挥作用的机制和特点了解非常有限，特别是多糖口服后与机体接触的肠道部位发生怎样的变化。香菇作为药食两用真菌，在食品、保健食品和药品领域都有广泛的应用。随着技术发展和研究深入，许多种香菇多糖已从香菇中得到分离和鉴定。在本课题的前期研究中，采用水提、醇沉从香菇子实体中得到一种香菇杂多糖（命名为L2），平均分子量（Mw）为26KDa。主要由葡萄糖(87.5%)、半乳糖(9.6%)和阿拉伯糖(2.8%)组成。香菇多糖L2在121℃及以下、pH4.0-8.0环境下，具有良好的免疫增强活性，其中TLR2（Toll-like receptor2）是L2的免疫细胞受体之一。在本课题中，利用NMR技术进一步表征L2的主链结构为β-D-(16)连接葡萄糖带少量-D-(16)连接阿拉伯糖，并在部分糖基上C-O3和C-O4上有分支。选用C57BL/6成年和老龄小鼠评估L2口服后免疫功能特性，L2使用40mg/kg day剂量连续灌胃小鼠四周，提高成年小鼠胸腺指数和脾脏指数（增加胸腺和脾脏重量），增加脾T淋巴细胞增殖能力和NK（Natural killer）细胞的杀伤活性，增加外周血清中IL-2(Interleukin2)、IFN-γ (Interferon γ)和IL-12的浓度；提高老龄小鼠的免疫功能，包括增加老龄小鼠的脾脏指数、脾淋巴细胞增殖能力、外周血中IL-2和IL-6的浓度。针对L2对小鼠肠道细菌组成影响，利用第二代高通量焦磷酸测序技术（测16S rRNA基因），检测成年及老年小鼠粪便菌群组成结构。结果表明L2显著改变成年小鼠肠道菌群结构，包括增加小鼠粪便菌群的丰富度，但降低粪便菌群的多样性。然而，L2提高老龄小鼠粪便菌群组成的丰富度、多样性和均匀性。表明香菇多糖对肠道菌群结构的多样性、均匀性具有双向调节作用，调节的方向与属主免疫功能状态相关。具体地，对成年小鼠而言，在门(phylum)分类水平上，变形菌门（Proteobacteria）比例显著性增加；在纲(class)分类水平上，-变形菌纲（Epsilonproteobacteria）比例显著增加；在科(family)分类水平上，螺杆菌科（Helicobacteraceae）比例显著增加，而S24-7比例显著降低。特别地，在种（species）水平上，Helicobacter suncus显著增加；而对老龄小鼠，在门（phylum）、纲（class）和科(family)分类水平上，香菇多糖L2能部分恢复小鼠老龄相关的肠道粪便菌群结构的变化，如扭转衰老相关的F/B值和Bacteroidia比例的增加。这些变化可能与L2对肠粘膜免疫系统的调节特性和肠道菌群的营养性增殖作用有关。L2对成年小鼠和老年小鼠的免疫调节和肠道菌群组成影响的结果表明了L2的免疫调节作用可能与肠道菌群中Helicobacter（如Helicobacter suncus）、Alistipes和Bacteroides acidifaciens中的一些细菌比例变化有关。在沿肠道的菌群空间影响方面，L2降低成年小鼠盲肠和结肠部位菌群的丰富度、多样性和均匀性，但对小肠部位菌群的丰富度、多样性和均匀性无明显影响。具体而言，在门(phylum)分类水平上，增加小肠部位的菌群门类的种类；在盲肠部位，变形菌门（Proteobacteria）的比例上升而蓝细菌门（Cyanobacteria）的比例下降；在结肠部位，拟杆菌门（Bacteroidetes, B）,变形菌门（Proteobacteria）的比例增加，而厚壁菌门（Firmicutes, F）的比例下降，呈现偏向拟杆菌为主导。结果提示免疫功能变化与肠道菌群的多样性、均匀性和丰富度的变化有关联。L2对肠道菌群的影响既可能包括通过影响免疫系统功能对肠道菌群的间接作用，也有香菇多糖L2被肠道菌群发酵利用的作用。为了考察L2对肠道上皮细胞的直接影响，利用Caco-2/RAW264.7cells模型，考察L2对肠上皮细胞免疫因子分泌的作用特点。研究显示，L2刺激肠上皮细胞Caco-2分泌的免疫因子模式与酵母多糖Zymosan A不同，提示不同结构的多糖口服后可能呈现不同特征的免疫调节作用。同时，L2对Caco-2细胞分泌的免疫因子模式受到肠道革兰氏阴性菌成分LPS和免疫细胞参与影响，提示香菇多糖L2、肠粘膜免疫系统和肠道菌群之间复杂的相互作用。利用RT-PCR(Real time-PCR)对成年小鼠沿肠道免疫基因相关基因表达检测表明，L2导致在小肠部位的基因表达以上调为主，而盲肠、结肠部位的基因表达则以下调为主。L2上调趋化因子、干扰素和白介素、肿瘤坏死因子、病原菌模式识别受体基因的转录；对TNF超家族成员则表现为下调作用；对细胞连结屏障功能和抗菌相关基因则既有上调也有下调；对TLRs先天免疫信号通路及细胞免疫调节相关基因则以下调为主。L2对沿肠道免疫相关基因的转录调节可能是通过直接对肠粘膜免疫系统的刺激作用和改变肠道菌群组成结构来实现。对差异表达基因利用R spider分析，分别构建出由15（小肠）、5（盲肠）、10（结肠）个基因组成的3个功能网络。在小肠部位功能主要涉及：免疫反应、调控细胞凋亡、异蛋白低聚化、血小板源生长因子受体信号通路、细胞内信号通路、正向调控DNA复制。在盲肠部位涉及功能是：B细胞激活、异蛋白低聚化。在结肠部位涉及功能是：发炎反应、细胞增殖、LPS调控的信号通路、T细胞激活和正向调控NF-kB转录因子活性。提示L2在肠道不同部位（小肠、盲肠、结肠）所影响及发挥的生理功能可能不一样，反映了肠道菌群与属主相互作用的复杂性和菌群—机体组织影响之间的特异性。最后，利用蛋白组学技术对成年小鼠小肠和结肠组织蛋白表达检测，L2对小肠组织蛋白的表达影响大于结肠组织蛋白。在小肠处鉴定出25个差异表达蛋白，在结肠处鉴定出22个差异表达蛋白。小肠、结肠处的差异表达蛋白仅有少量种类重叠，绝大部分均不同，提示L2的生物学作用广泛，进一步验证了L2口服后对肠道作用的组织部位特异性。大部分的差异表达蛋白生物学功能主要集中于细胞组成成分（cellular componentorganization）、发育过程调节(developmental process)、细胞内调节（cellular process）、免疫调节(immune system process)、代谢调节(metabolic process)、多细胞组织过程(multicellular organismal process)、刺激反应(response to stimulus)，并选取了12个蛋白进行Western blot验证，结果与2DE趋势符合。STRING蛋白互作网络分析，印证了L2对肠道组织蛋白的表达呈现组织部位特异性。表明L2对蛋白表达影响可能主要是通过肠道菌群调节和直接刺激作用而实现。