肺炎为小儿时期的常见病,多为支气管肺炎,好发于冬春季节或气候交替之际,是我国住院小儿死亡的第一原因,严重威胁儿童健康,被世界卫生组织列为全球三种重要儿科疾病之一,我国卫生部也将其列为重点防治的小儿四病之一。据统计,肺炎占目前城市医院儿科病区住院病例的25%-50%；而病毒性肺炎是小儿肺炎的常见类型,约占小儿肺炎总数的50%。在引起小儿病毒性肺炎的病原体中又以呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)为主,西医治疗小儿RSV肺炎缺乏有效的治疗手段,而中医药在治疗病毒感染性疾病方面有其独到的优势。导师汪受传教授领衔的课题组完成的临床研究表明,具有开肺化痰解毒活血功效的金欣口服液是治疗小儿病毒性肺炎痰热闭肺证的有效方剂。前期实验研究结果表明,金欣口服液有明显抑制RSV的作用,主要通过抑制病毒的膜融合,其作用位点可能是病毒的F蛋白或其受体；可明显减低RSV感染后Hep-2细胞病变程度,对细胞有保护作用；具有诱导单个淋巴细胞产生IL-2、IFN-γ的作用,增强机体抗病毒免疫功能。Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)是重要的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs),可以识别不同微生物的病原相关分子模式(pathogen associated molecule pattem, PAMPs)。TLRs在RSV感染过程中发挥着重要的作用,是研究RSV感染的新的方向。导师汪受传教授带领的团队承担的国家自然科学基金项目“金欣口服液对RSV活化的TLRs信号转导通路作用机制研究(81072840)”前期研究成果已表明金欣口服液能调控RSV感染活化诱导的TLR3、TLR4及下游信号分子的表达水平。RSV是单股负链RNA病毒,粘附融合宿主细胞后释放单链RNA,能被位于内体膜上的TLR7特异性识别,通过一系列信号传导途径,引起下游细胞因子的大量分泌,引起系统性炎症反应。鉴于中医药作用的多靶点性,本实验从TLR7及其介导的信号通路入手,探讨RSV感染时金欣口服液抗对TLR7信号转导通路的调控,及与其它TLRs的相关性。目的研究金欣口服液对RSV诱导的TLR7信号传导通路的调控作用,探讨其治疗RSV肺炎的可能免疫学机制。方法体外实验：RSV感染体外培养的RAW264.7细胞,采用金欣口服液含药血清进行干预,24h后收集细胞,real-time PCR法测定TLR7及其信号通路关键分子MyD88、NF-κB、IRF7mRNA的表达变化；Western Blot技术检测TLR7、 MyD88、NF-κB、IRF7蛋白表达,激光共聚焦技术检测TLR7在RSV感染RAW264.7细胞中的表达及分布；ELISA法检测细胞上清中TNF-α、IFN-α表达情况；并用TLR7siRNA干扰后检测上述指标,观察金欣口服液对RSV诱导的TLR7传导通路影响及与其它TLRs信号通路的相关性。体内实验：RSV滴鼻感染BALB/c小鼠,金欣口服液进行干预,并于首次滴鼻后72、144小时,取小鼠肺组织,分别行病理组织切片评价肺部病变情况,real-time PCR法检测肺组织中TLR7、MyD88、NF-κB、IRF7mRNA表达情况,Western Blot法检测小鼠肺组织TLR7、MyD88、NF-κB、IRF7蛋白表达情况；取小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF), ELISA法检测TNF-α、IFN-α表达情况。结果一、体外实验1.TLR7siRNA转染前(1)RSV感染RAW264.7细胞24h后,TLR7、NF-κB、IRF7mRNA表达明显升高(超过正常组2倍以上,与正常组比较,P<0.01),对MyD88mRNA的表达能提高,但没超过2倍：金欣口药血清组能明显降低TLR7、MyD88、NF-κB mRNA表达(P<0.01),对IRF7mRNA的表达下调作用不明显(P>0.05)。(2)RSV感染RAW264.7细胞24h后,TLR7、MyD88、NF-κB蛋白表达量较正常组明显升高(P<0.01),而IRF7的蛋白表达无明显改变；金欣口服液含药血清组TLR7、MyD88、NF-κB蛋白表达量较RSV感染组明显降低(P<0.01)；对IRF7的蛋白表达无调控作用。(3)RSV感染RAW264.7细胞24h后,细胞培养上清中IFN-α未能检测到；TNF-α表达量明显升高(与正常组比较,P<0.01)。金欣口服液含药血清显著降低TNF-α表达(P<0.01)。2. TLR7siRNA转染后(1) TLR7siRNA转染RAW264.7细胞后,TLR7mRNA的表达量下降46.6%,再用RSV感染,可见TLR7mRNA的表达又有明显增高(超过TLR7siRNA转染组的2倍以上),表明用筛选出的TLR7siRNA可干扰TLR7mRNA的生成。TLR7信号通路下游信号分子MyD88、NF-κB mRNA的表达也受到抑制,但其抑制率低于TLR7mRNA(分别为26.9%、27.3%),未成平行抑制关系,表明MyD88、NF-κB mRNA的表达可能还受其它因素的调控,特别是TLRs家族的其它成员。TLR7siRNA转染后IRF7mRNA的表达未受明显影响。(2)金欣口药血清能明显降低转染及RSV感染后的TLR7、MyD88、NF-κB mRNA表达(P<0.01),对IRF7mRNA的表达下调作用不明显(P>0.05)。(3)RSV感染RAW264.7细胞24h后,TLR7、MyD88、NF-κB蛋白表达量较正常组明显升高(P<0.01),而IRF7的蛋白表达无明显改变；金欣口服液含药血清组能明显下调TLR7、NF-κB蛋白表达量(P<0.01),但对MyD88的调控不明显(P>0.05)；对IRF7的蛋白表达无调控作用。(4) TLR7siRNA转染后继以RSV感染RAW264.7细胞24h后,细胞培养上清中IFN-α仍未能检出；TNF-α表达量明显升高(与正常组比较,P<0.01),金欣口服液含药血清显著降低TNF-α表达(P<0.01)。二、体内试验(1)RSV感染BALB/c小鼠后肺部病理改变主要表现为肺间质性病变,肺泡壁血管扩张充血,水肿增厚,肺泡壁及间质炎性细胞浸润；肺泡腔无明显渗出物；支气管腔内无显著炎性渗出物,上皮细胞无显著变性、坏死。随着感染时间的延长,肺部病变程度逐渐加重。金欣口服液组小鼠肺内炎症均有不同程度减轻,病理评分结果显示治疗组各时间点与RSV感染组相比均有统计学显著性差异。(2)RSV感染BALB/c小鼠72h后,肺组织中TLR7、MyD88、NF-κB mRNA表达显著增高(与正常组比较,P<0.01),而144h组随着感染时间的延长,TLR7、 MyD88、NF-κB mRNA的表达则下降。金欣口服液组TLR7、MyD88、NF-κB mRNA表达较RSV感染组不同程度降低(P<0.01或P<0.05)。RSV感染BALB/c小鼠72、144h后,肺组织中IRF7mRNA表达量与正常组比较无统计学差异(P>0.05),金欣口服液高剂量组在感染72h能下调IRF7mRNA表达(P<0.05),金欣口服液高剂量组、等效剂量组在144h能上调IRF7mRNA表达,但无统计学差异(P>0.05)。(3)RSV感染BALB/c小鼠72h后肺组织内TLR7、MyD88、NF-κB蛋白表达量较正常组高(P<0.01或P<0.05),144h表达下降与正常组无明显差异。金欣口服液组TLR7、MyD88、NF-κB蛋白表达量于72h较RSV感染组不同程度降低(P<0.01或P<0.05),感染144h金欣口服液组TLR7、MyD88、NF-κB表达量下降较RSV组差异无统计学意义(P>0.05)。RSV感染BALB/c小鼠72h后肺组织内IRF7蛋白表达量较正常组无显著差异(P>0.05),144h表达较正常有所上升(P>0.05)。金欣口服液组IRF7蛋白表达量于72h较RSV感染组无统计学差异,感染144h金欣口服液组能上调IRF7蛋白表达(P<0.01)。(4)RSV感染BALB/c小鼠72h后,BALF中TNF-α、IFN-α表达量均明显升高(与正常组比较,P<0.01);144h, BALF中TNF-α、IFN-α下降。72h,金欣口服液组小鼠BALF中TNF-α、IFN-α表达较感染组显著上升,随着感染时间的延长,144h金欣组TNF-α、IFN-α表达明显下降。结论1.金欣口服液能明显减轻RSV感染小鼠的肺部炎症。2.金欣口服液对TLR7信号通路TLR7、MyD88、NF-κB mRNA及蛋白表达有明显的调控作用,对IRF7的表达在RSV感染早期无明显调控,晚期可上调IRF7的表达。3.金欣口服液能够显著上调RSV感染初期TLR7介导的信号通路下游TNF-α、IFN-α等炎症细胞因子的表达；随着感染时间的延长,金欣口服液能适当下调TNF-α、IFN-α的表达,具有双向动态调节作用。4.金欣口服液是治疗RSV感染的有效药物,其作用是通过调节RSV诱导的TLR7信号通路实现的,主要依赖的是TLR7/MyD88/NF-κB/TNF-α途径,在我们的实验中发现TLR7/MyD88/IRF7/IFN-α途径在RSV感染早期作用不明显。5. TLR7siRNA转染后,TLR7mRNA及蛋白表达明显受抑,但MyD88、 NF-κB mRNA及蛋白的抑制率低于TLR7,表明MyD88、NF-κB的表达还受其它TLRs调控,从而说明TLR7信号通路只是RSV感染后的一个通路,而金欣口服液亦可通过其它通路调控下游信号分子生成,体现了中药复方发挥作用的多靶点效应；TLR7siRNA转染与否对IRF7的表达无明显影响。