黄河蜜甜瓜植株再生及农杆菌介导的黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因转化方法的研究

来源 :甘肃农业大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:arx2007
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本论文通过试验建立了黄河蜜甜瓜植株再生体系,在愈伤组织水平上,利用土壤农杆菌对来源于实生苗的外植体进行CMV CP基因遗传转化,首次通过农杆菌介导将黄瓜花叶病毒外壳蛋白(CMV CP)基因转入黄河蜜甜瓜植株内。通过PCR-Southern证明获得了转基因植株。 以子叶和下胚轴为外植体,都能不同程度地诱导出愈伤组织,并得到再生植株,但子叶优于下胚轴。子叶以MS+6-BA0.4mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L培养基上诱导愈伤组织效果最好,诱导率高达97.1%,以MS+6.BA1.5mg/L+蔗糖30g/L培养基次之,诱导率为87.2%,以MS+6-BA2.0mg/+2,4-D0.2mg/+蔗糖30g/L最差。芽分化过程中,以MS+6-BA0.8mg/L+IAA0.2mg/L+蔗糖30g/L培养基最理想,平均芽分化数为10.8个,芽在伸长过程中黑暗处理2天,利于生根,在1/2MS+IAA0.2mg/L+蔗糖20g/L培养基上诱导生根效果最佳,生根率可达73.2%;下胚轴以MS+6.BA0.4 mg/L+NAA1.0 mg/L+蔗糖30g/培养基诱导愈伤组织效果最佳,诱导率为86.4%,以MS+6-BA2.0mg/L+2,4-D0.2mg/L+蔗糖30g/L培养基次之,诱导率为73.8%,以MS+6-BA1.5mg/L+蔗糖30g/L培养基最差。芽分化以MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L培养基最好,平均每块愈伤组织分化的芽数为9.4个,芽在伸长过程中经过黑暗处理2天,利于生根,在1/2MS+IAA0.5mg/L+蔗糖20g/L培养基上诱导生根效果最理想,生根率为67.2%。 利用整合有CMV CP基因以及Kan抗性基因、NPT-Ⅱ为报告基因的改建质粒pBin438,以农杆菌为载体,对黄河蜜甜瓜子叶和下胚轴进行了转化。通过试验确定Carb500mg/L能有效地抑制农杆菌的生长,Kan100mg/L是最佳选择压。预培养时间、AS浓度、供试菌株的生理活性和NAA浓度均影响转化率,子叶外植体预培养2天可以显著提高转化效率,在共培养时加入AS40umol/L可以提高转化率2.1%,用pH5.6的YEP液活化供试菌株,转化效果较好,NAA浓度子叶以0.1mg/L、下胚轴以1.0mg/L有利于转化,本转化系统获得愈伤组织最高转化率为12.8%。最终得到了Kan的抗性愈伤组织,经过对Kan~r愈伤组织的诱导分化,获得了完整的转化植株。PCR检测结果表明,转基因黄河蜜甜瓜植株已整合了CMV CP基因。
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