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【背景】肺炎链球菌是一种常见革兰阳性致病菌,可引起肺炎、脑膜炎、败血症、鼻窦炎及中耳炎等疾病。由于抗生素的滥用,已经出现了耐万古霉素和多重耐药性的肺炎链球菌菌株。世界卫生组织建议将肺炎链球菌结合疫苗纳入国家免疫计划,并将S.pn疫苗列为全球最急需的前3位疫苗之一。目前已上市的23价荚膜多糖疫苗和7-13价的荚膜多糖结合疫苗由于存在荚膜转换、成本高昂等种种不足,限制了它们的推广使用。因此开发新型肺炎链球菌疫苗迫在眉睫。减毒活菌疫苗是一种免疫原性强、保护效果好、成本低廉的疫苗。由于通过传统方法不易获得减毒菌株,因此其开发有一定的困难。本课题组在基因突变实验中偶然获得了一株荚膜丢失的菌株,前期研究显示其较肺炎链球菌无感染致病能力的R6菌株的毒力还弱,因此安全性较高,有望开发成一种减毒活菌疫苗。本研究拟在全面鉴定其安全性的基础上,对其保护作用进行评价,并进行初步的分子机制研究,为该活菌疫苗的研发提供可靠的实验依据。【方法】通过荚膜检测、荚膜磷壁酸检测、溶血活性检测、小鼠体内毒力实验、肺组织病理切片观察及缺陷菌在小鼠体内定植来评价D39△CPS-TA的安全性;候选疫苗免疫小鼠后,通过检测特异性抗体效价、疫苗对定植的保护效果、疫苗对肺炎和败血症的保护效果、疫苗对临床菌株的保护效果及疫苗的长期保护效果来评价D39△CPS-TA的有效性;最后通过检测抗体亚型、抗体的被动保护效果及细胞因子的检测来初步探讨D39△CPS-TA的保护机制。【结果】D39△CPS-TA作为减毒活菌疫苗安全性较好。与D39相比,D39△CPS-TA的荚膜明显变薄变稀;荚膜磷壁酸的表达量显著减少;溶血活性也显著降低;毒力明显减弱;对小鼠肺组织只引起轻微的可耐受的炎症,损伤较轻;在小鼠体内的定植能力也明显减弱,24小时后完全被清除。减毒活菌疫苗D39△CPS-TA的保护效果很好。免疫小鼠后,D39△CPS-TA可以诱导高效价的特异性抗体;也能减少肺炎链球菌19F和TIGR4在小鼠体内的定植;可以对D39引起的肺炎和败血症产生很好的保护效果,特别是粘膜免疫的保护效果达100%;对临床菌株6B和3型感染的保护效果也较市面疫苗好(p<0.05);粘膜免疫对小鼠长期保护效果为100%,系统免疫的保护效果为75%。抗体的被动保护效果为100%;其抗体亚型主要为IgG1、IgG2a、IgG2b;D39△CPS-TA系统免疫产生高水平的IL-10,而粘膜免疫产生高水平的IL-10、IL-17A和IFN-γ。【结论】D39△CPS-TA作为减毒活菌疫苗安全性较高。它对小鼠的保护效果非常好,尤其是通过粘膜途径免疫,其对多种血清型肺炎链球菌感染的保护效果都可达100%,较市面上的疫苗效果好。其通过系统免疫主要诱导体液免疫反应,通过粘膜免疫既可诱导体液免疫反应也可诱导细胞免疫反应。