论文部分内容阅读
目的：研究脑出血后自噬相关蛋白表达规律、研究阻断NF-κB信号通路对脑出血后自噬激活及细胞质膜完整性破坏的影响,并对其调节机制进行初步探讨。
方法：体内试验。采用纹状体部位注射胶原酶Ⅳ法建立小鼠脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)模型,建立模型前5 min分别侧脑室注射SN50(NF-κB的特异性抑制剂,0.1μg/1μ1)或等体积生理盐水,脑出血对照组不做任何预处理直接建立模型,同时设立空白对照组。各组按出血后时间不同分为出血后1 h,6 h,24 h,48 h和7 d组,各组分别于处死前1 h用腹腔注射法将碘化丙啶(propidium iodide,PI)注入各组小鼠体内,采用体视学显微镜分别计数各组出血中央区及出血周边区PI阳性细胞数,研究脑出血后细胞质膜完整性破坏的变化规律以及阻断NF-κB对脑出血引起的细胞质膜完整性破坏的影响；采用Motor Test评估脑出血后各组动物的运动功能；运用Western blot法和免疫组织荧光法观察脑出血后各组脑组织中自噬相关蛋白LC3,Bcl-2,Beclin-1的表达情况。体外实验:体外培养PC12细胞。传代时将细胞分为三组：一组培养基中加入Hemin,一组培养基中加入Hemin的同时加入SN50,各组于24 h、48 h后终止培养,收集细胞。同时设立空白对照组。Western blot检测自噬相关蛋白LC3、Beclin-1、Bcl-2的表达情况。
结果：与正常小鼠相比,脑出血后PI阳性细胞数随时间变化逐渐增多,其中出血中央区阳性细胞数高峰出现在48 h时、出血周边区24 h时达高峰。至7 d时细胞死亡数目达稳定(均P<0.05)。免疫印记实验结果显示脑出血后Beclin-1蛋白表达增多,Bcl-2蛋白表达下降,但Beclin-1/Bcl-2比值升高；LC3蛋白表达显著增加(均P<0.05)；与盐水处理组相比,SN50处理组小鼠脑出血后出血周边区PI阳性细胞数目无明显减少,出血中央区PI阳性细胞24 h-48 h时显著减少(P<0.05),至7 d时已无明显减少。行为学实验结果显示:与盐水处理组相比,SN50处理组脑出血后运动功能无明显改善,免疫印记实验结果显示SN50促进了Beclin-1表达的增加,Bcl-2蛋白表达先下降后升高,Beclin-1/Bcl-2比值升高,增强了脑出血诱导的LC3表达的激活(均P<0.05)；PC12细胞免疫印记实验结果显示:SN50促进了Hemin诱导的LC3的表达上调；促进了Beclin-1表达的上调,逆转了Hemin诱导的Bcl-2的下调,Beclin-1/Bcl-2比值增加(均P<0.05)。
结论：脑出血可以造成细胞质膜完整性破坏,脑出血后24 h～48 h质膜完整性遭破坏的细胞数量达高峰,表现为PI阳性细胞显著增多；SN50可以暂时缓解脑出血造成的出血中央区的细胞质膜完整性破坏,但对延迟性的细胞死亡无明显作用。脑出血后自噬被激活,自噬部分参与了脑出血引起的细胞死亡；SN50能够促进脑出血后自噬的激活,这种激活至少部分通过Beclin-1/Bcl-2的调节来实现。