论文部分内容阅读
冷胁迫是不利的环境因素之一,可以导致植物的各种代谢产物发生变化,影响其正常生长发育,从而限制了作物的生产与产量。甘氨酸甜菜碱（Glycinebetaine,GB）,又被简称为甜菜碱,广泛分布于植物体内,是一种高效无毒的小分子渗透调节物质,可以调节细胞内的渗透压,在植物逆境响应中发挥着重要的作用。众所周知,植物在寒冷、干旱或盐等胁迫下可以引起甜菜碱在细胞内的积累,然而,这一生理反应的具体作用机制及涉及到的转录调控网络尚不清楚。枳（Poncirus trifoliata（L.）Raf.）属于芸香科枳属,在柑橘生产中通常被用作于砧木。经低温完全驯化后,枳可以在-26℃的低温环境中生存,但是具体的耐寒机制研究仍不够透彻。实验室前期通过利用RNA-Seq高通量测序技术构建了枳低温应答的转录组,并筛选发掘了一批低温响应基因。在此基础上,我们从中鉴定出一个冷诱导的枳甜菜碱醛脱氢酶（Betaine aldehyde dehydrogenase）基因（命名为PtrBADH）,对其进行了抗寒功能分析,并成功分离了其上游转录因子MYC2,阐明了冷胁迫下GB积累的转录调控机制。主要研究结果如下:1.PtrBADH是一个枳低温应答基因。在枳低温应答表达谱中,从上调的差异表达基因里发现三个非全长基因unigene0018527、unigene0018528和unigene0018529,均显著受低温胁迫诱导,经甜橙数据库中的BLAST-N序列比对,发现它们均与Cs9g02320（CsBADH）基因的同源性最高。利用同源序列法从枳中克隆获得全长基因,命名为PtrBADH,该基因包含1788bp的开放阅读框,编码595个氨基酸,预测蛋白质分子质量为65.605 kDa,等电点pI为6.62,蛋白不稳定指数Ⅱ计算值为34.34,属于稳定蛋白质。亚细胞定位分析,PtrBADH位于内质网。枳低温处理后,PtrBADH表达量、BADH活性和GB含量均明显增加。这些结果表明,PtrBADH确实受低温上调表达,并参与枳冷胁迫下甜菜碱的积累。2.PtrBADH抗寒功能验证。通过农杆菌介导获得了超表达PtrBADH的烟草和柠檬转基因植株,利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）获得了PtrBADH沉默系（简写为TRV-PtrBADH）。低温处理前,所有植株均表现出正常良好的生长状态且测定的生理指标也无明显的差异。低温处理后,过表达PtrBADH的烟草和柠檬转基因植株表型较好,相对电导率、丙二醛（MDA）及活性氧（H2O2、O2·-）累积显著低于野生型,光合作用效率、BADH活性和GB含量则表现出增长的趋势,说明抗寒性明显增加;而TRV-PtrBADH系的受害程度更严重,GB含量也比对照低,对低温更敏感,外源GB能部分恢复沉默系的抗寒性。这些结果表明,PtrBADH在枳抗寒中起到正调控的作用。3.PtrBADH上游调控因子分离与鉴定。构建了PtrBADH启动子缺失载体,瞬时表达实验发现,该启动子区域（即-786～-213）为PtrBADH冷响应所必需。采用-786～-213片段作为诱饵,通过酵母单杂交筛选枳低温cDNA文库,得到一个bHLH类的转录因子MYC2（命名为PtrMYC2）。PtrMYC2全长2055 bp,编码684个氨基酸,包含JAZ类蛋白作用区域（JID）、转录激活区域（AD）和典型的bHLH保守结构域。PtrMYC2定位于细胞核且具有转录激活活性。同时,表达量分析表明,PtrMYC2受低温、茉莉酸和乙烯诱导,但对盐胁迫不是很敏感。4.PtrMYC2抗寒功能鉴定。通过农杆菌介导获得了超表达PtrMYC2的烟草转基因植株和VIGS系（简写为TRV-PtrMYC2）。抗寒性分析发现,超表达PtrMYC2增强了转基因烟草NtBADH表达量、BADH活性和GB的积累,明显提高了转基因烟草的抗寒性;相反,枳PtrMYC2被沉默后显著降低了 TRV-PtrMYC2植株的PtrBADH表达量、BADH活性和GB含量,对低温更加敏感。这些结果表明,PtrMYC2可能是通过调控GB积累在枳抗寒中发挥重要作用。5.PtrMYC2调控低温下GB积累的机制研究。经酵母单杂交（Y1H）、凝胶电泳迁移（EMSA）和染色质免疫沉淀（ChIP-PCR）分析发现,PtrMYC2能特异地结合PtrBADH启动子区域的G-box;双荧光素酶活性检测表明,PtrMYC2是PtrBADH启动子的转录激活子。通过农杆菌介导获得了超表达PtrMYC2的甜橙愈伤转基因系和VIGS系,表达分析发现,低温下BADH表达量在超表达PtrMYC2的甜橙愈伤系中明显增加,而在VIGS系中则显著减少,表明PtrMYC2通过特异性结合PtrBADH的启动子来激活其表达,从而促进低温条件下GB的合成,增强植物的抗寒性。6.低温下GB合成依赖于PtrMYC2调控JA途径。冷处理诱导了 JA合成相关基因的表达,促进了枳内源JA水平的增加;且外源茉莉酸甲酯（MeJA）显著增强枳PtrMYC2和PtrBADH的表达以及GB的积累,而布洛芬处理（JA合成抑制剂,IBU）则降低了PtrMYC2和PtrBADH的表达以及GB的合成积累和植物的耐寒性。利用PtrMYC2超表达愈伤组织和VIGS系枳分析发现,JA诱导的GB积累依赖于PtrMYC2。上述结果表明,枳低温下内源GB的积累依赖于PtrMYC2介导的JA信号途径。