论文部分内容阅读
水仙(Narcissus)是世界著名的球根花卉,它植株清秀、花型独特,具有极高的观赏价值。然而水仙花色单一,丰富的花色一直是水仙育种的重要目标,而水仙不同品种花色差异的分子机理尚未揭示。充分理解水仙花色形成的分子机理可以为水仙花色的人工调控及水仙花色遗传改良提供理论依据。本研究对有性杂交获得的大量水仙株系进行了评估。在诸多杂交株系中,‘Slim Whitman’和‘Pinza’的杂交后代花色差异较大,表现突出,被用作研究水仙花色差异的主要试验材料。水仙品种‘Slim Whitman’具有白色的花瓣和浅黄色副冠,随着花朵的衰老,副冠颜色逐渐变浅至白色;品种‘Pinza’具有黄色的花瓣和黄色-橙红色的副冠。在测定两品种花瓣和副冠中类胡萝卜素组分与含量变化的基础上,通过RNA-Seq技术测定水仙‘Slim Whitman’和‘Pinza’花瓣及副冠的转录组,从中找出与水仙花色形成相关的差异表达基因。通过生物信息学和荧光定量PCR手段鉴定与类胡萝卜素生物合成通路相关的结构基因,并对参与类胡萝卜素降解的关键基因NpCCD4进行了鉴定和功能研究,从而揭示水仙不同品种花色差异的分子机制。主要研究结果如下:1.水仙杂交后代评价本实验以有性杂交获得101个不同基因型的F1代水仙株系为材料。连续三年统计了水仙杂交株系的生长繁殖情况和表型特征。部分杂交株系繁殖率高,抗病性好,经过无性扩大繁殖,已形成一定群体规模。2.水仙品种‘Slim Whitman’和‘Pinza’及其杂交后代表型与聚类分析以水仙‘Slim Whitman’和‘Pinza’正反交得到的27个后代株系为材料,通过调查‘Slim Whitman’、‘Pinza’及其杂交后代的20个表型性状,发现杂交株系的花色、株高等多个表型性状均存在较大的遗传变异。根据表型特征进行聚类分析,27个杂交株系及其亲本被分为不同的类群,其中SP04等杂交株系具有较高的观赏价值,有望通过扩大繁殖成为水仙新品种。3.水仙‘Slim Whitman’、‘Pinza’及其杂交后代花瓣与副冠类胡萝卜素成分与含量分析通过HPLC-MS/MS技术对水仙‘Slim Whitman’、‘Pinza’及其杂交后代花瓣和副冠中类胡萝卜素组分进行定性定量分析。结果显示,共检测到all-trans-lutein、9-cis-violaxanthin和all-trans-β-carotene等10种类胡萝卜素。‘Slim Whitman’花瓣和副冠中总类胡萝卜素含量先升高后降低,在S3期达到最高值,S4期之后,除all-trans-neoxanthin和9-cis-neoxanthin外,各种类胡萝卜素组分剧烈减少,与观测到的褪色现象一致。而‘Pinza’花瓣和副冠中总类胡萝卜素含量远高于‘Slim Whitman’的花瓣与副冠中的含量,S5期达到最高值,而且在花朵发育后期没有出现类胡萝卜素降解的情况。在杂交后代株系中,白色花瓣株系中类胡萝卜素含量也比黄色花瓣株系中的低。在水仙‘Pinza’和部分杂交株系副冠的橙红色部分,all-trans-β-carotene的相对百分含量更高。4.‘Slim Whitman’和‘Pinza’花瓣和副冠转录组分析为了系统地研究‘Slim Whitman’(SW)和‘Pinza’(PZ)两品种的花色差异的分子机理,分别以这两个品种的盛开期花瓣(P)和副冠(C)为材料进行了转录组测序,共获得67.13 GB的Clean Reads,组装成84,463个unigenes。通过与各公共数据库进行比对和功能注释,共获得30,156条unigene的注释结果。差异基因分析显示,SWP vs SWC和PZP vs PZC两组对比中,共得到730和3,317个DEGs;SWP vs PZP和SWC vs PZC两组对比中,共得到1,022和3,880个DEGs。进一步差异基因富集分析显示,在水仙的不同品种和不同组织中,类胡萝卜素生物合成途径(ko00906)的差异基因显著富集。5.水仙中参与类胡萝卜素生物合成途径相关基因的定量分析水仙花色差异主要原因是类胡萝卜素积累量的差异。应用qRT-PCR技术,以水仙不同品种、不同组织中稳定表达的ACT作为内参基因,详细分析了水仙不同品种,以及同一品种不同组织中类胡萝卜素生物合成途径关键酶基因的表达量。结果表明,GGPPS、PSY等上游基因在‘Slim Whitman’和‘Pinza’副冠中的表达量高于在其花瓣中的表达量,而在不同品种之间表达量没有明显差异。而CCD基因(c77684.graph_c0)的表达量在两个品种之间具有极显著的差异:在‘Slim Whitman’花瓣和副冠中大量表达,而在‘Pinza’的花瓣和副冠中几乎不表达。据此推测,PSY等上游基因表达量主要影响同一品种的花瓣和副冠中类胡萝卜素的积累量,而CCD基因(c77684.graph_c0)对不同品种中类胡萝卜素的积累量具有显著影响。6.水仙NpCCD4基因的克隆与功能研究首次从水仙中克隆了类胡萝卜素双加氧裂解酶基因NpCCD4。该基因编码区域全长1806 bp,编码601个氨基酸,具有CCD基因保守的结构区域。时空表达分析显示,该基因主要在‘Slim Whitman’的盛开后的花瓣和副冠中表达,在鳞茎、叶片和花亭中表达量低,在品种‘Pinza’的各组织中几乎不表达。通过VIGS技术沉默‘Slim Whitman’副冠中的NpCCD4基因,阳性单株的副冠中大量积累类胡萝卜素,特别是all-trans-β-carotene,其副冠呈现为橙红色。可见,水仙NpCCD4具有降解类胡萝卜素的生物活性。NpCCD4的表达量差异是导致‘Slim Whitman’和‘Pinza’两个水仙品种花色不同的关键因素之一。