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研究背景肾移植是治疗终末期肾病的最有效措施,但术后排斥反应制约了其疗效。随着新型免疫抑制药物的临床应用和并发感染的预防,提高了肾移植病人的短期生存率,然而长期服用免疫抑制剂,导致感染及恶性肿瘤的发生率明显增加,影响了患者的长期存活。因此,寻找一种使机体产生免疫耐受的方法替代免疫抑制剂,既可以降低排斥反应的发生率,同时避免长期服用免疫抑制剂带来的不良反应,可能是改善肾移植的一种很有前途的方法。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一类具有自我复制和多向分化潜能的多能干细胞,在不同的诱导条件下,它们可以分化为多种组织,包括脂肪、骨、软骨、肝和肾等。此外,骨髓间充质干细胞具有低免疫原性和免疫抑制作用,并能优先归巢于损伤组织,促进组织修复,但其改善能力有限,移植细胞向损伤肾脏的归巢数量有限是影响修复效率的原因之一。促红细胞生成素(EPO)是一种能调节红系祖细胞生长分化的糖蛋白,其对于治疗肾损伤的有效性已被广泛证明。目前鲜有相关研究表明EPO是否会对BMSCs移植的定向肾脏归巢及旁分泌有益,从而增强移植治疗效果,降低肾移植术后排斥反应的发生。本实验对EPO预处理BMSCs后能否降低大鼠肾移植术后排斥反应的发生率进行初步研究。目的构建同种异体大鼠肾移植模型,经尾静脉注射促红细胞生成素(EPO)预处理的骨髓间充质干细胞(BMSCs),观察BMSCs对预防大鼠肾移植术后排斥反应的作用。方法1、肾移植模型的建立与分组选取SDF级体重(200～250)g的雄性SD、Wistar大鼠各24只,检疫室预养3d,模型建立后随机分为4组,每组6只,2%戊巴比妥钠溶液(30mg/kg)腹腔注射麻醉,供肾用1%肝素水灌注苍白后,低温冰桶保存。分别麻醉供、受鼠后行原位肾移植手术,术后开放血流,若肾脏充盈良好,血供丰富,且5分钟内不变黑,则关闭腹腔,成功建立大鼠肾移植模型。对照组(肾移植未干预组):大鼠肾移植模型建立后,未进行任何干预;EPO干预组:肾移植建模后立即予1ml含有500IU的EPO尾静脉注射;BMSCs移植组:肾移植建模后尾静脉注射1ml含有1×106个BMSCs的PBS液;EPO-BMSCs组:肾移植建模后尾静脉注射1ml经EPO体外预处理的含有1×106个BMSCs的PBS液。各组大鼠均在温度、湿度适宜的环境下饲养,自由饮食、饮水。分别于建模后1d、5d处死部分大鼠(每次每组处死3只),下腔静脉取血,分离血清后-20℃冰箱保存备用,检测血肌酐。肾移植术后1d、5d分别取受者双侧肾脏,新鲜标本-80℃冻存,留做Western-blot检测,10%甲醛固定标本备作病理。2、血肌酐水平检测肾移植术后,第1天和第5天,从肾移植大鼠取血标本,分离血清,并用试剂盒检测血清肌酐。3、组织病理学观察组织标本10%甲醛固定、石蜡包埋后,取5μm切片脱蜡至水,按常规方法分别行HE染色切片,每例切片在高倍镜下(200×)随机观察10个互不重叠肾单位视野并拍照,分析炎症及排斥反应发生的可能性。4、Western Blot取肾组织80-100 mg加入1ml三去污裂解液,4℃20 000r/min离心10 min,取上清再次4℃12 000 r/min离心10 min,BCA蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度,取30μg蛋白进行SDS-PAGE电泳。蛋白转移至PVDF膜上,将PVDF膜放入4mL含5%的BSA/TBST室温70rmp摇动封闭1h,加入4mL抗体/BSA稀释液室温孵育半小时后,4℃冰箱孵育摇床过夜,TBST洗膜,70rmp3次×10 min,加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(1:2000)二抗,室温摇动1h,洗膜3次×10min,置于伯乐化学发光成像系统中成像,CCD自动获取图片结果。采用ImageJ图像分析软件对获得每个特异性条带积分灰度进行半定量分析。测量条带的灰度值,β-actin为内参,各蛋白的表达强度为两者灰度的比值。5、统计学分析方法计量资料采用均值±标准差来表示,t检验用于分析两组间的差异,多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),需进行Student-Newman-Keuls方差齐性检验,用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计学分析,P<0.05表示差异具有统计学意义。结果1、血肌酐水平大鼠肾移植术后第1天,与EPO-BMSCs组血肌酐水平相比,对照组、EPO组及BMSCs组血肌酐水平较高,但差异无统计学意义(P>0.05);术后第5d,与EPO-BMSCs组血肌酐比较,对照组、EPO组及BMSCs组血肌酐水平较高,且差异有统计学意义(P<0.05)。2、组织病理学检查结果:移植后第1天,每组均发生炎症反应,对照组3例中2例发生排斥反应,其余各组未发生排斥反应,但每个移植肾都是肿胀的。术后第5天,对照组3例和EPO组3例均发生排斥反应。BMSCs组3例中有1例发生排斥反应,EPO-BMSCs组无急性排斥反应。移植肾形态肿胀,急性排斥反应发生时,移植肾呈暗红色。3、Western Blot 结果Western Blot检测表明,大鼠肾移植术后第一天,与EPO-BMSCs组相比,对照组、EPO组和BMSCs组的IFN-γ灰度值比值更高,但EPO-BMSCs组与BMSCs组相比,差异无统计学意义(P>0.05);术后第5天,与EPO-BMSCs组相比,对照组、EPO组和BMSCs组IFN-γ灰度值明显升高,且差异有统计学意义(P<0.05)。大鼠肾移植后第1天,与EPO-BMSCs组比较,对照组、EPO组和BMSCs组IL-4灰度值比值更高,但差异无统计学意义(P>0.05);肾移植术后第5天,与EPO-BMSCs组相比,对照组、EPO组和BMSCs组IL-4灰度值比值不同,但差异无统计学意义(P>0.05)。肾移植术后第1天,与EPO-BMSCs组比较,对照组、EPO组和骨髓间充质干细胞组(IFN-γ/IL-4)灰度值比值更高,但差异无统计学意义(P>0.05);术后第5天,与EPO-BMSCs组比较,对照组、EPO组和BMSCs组的(IFN-γ/IL-4)灰度值比值明显增高,且差异有统计学意义(P<0.05)。结论EPO预处理BMSCs可降低急性排斥反应的发生率,可能是通过增加注射的间充质干细胞到达移植肾脏的数量,及调节相关免疫因子的表达,如调节IL-4、IFN-γ、IFN-γ/IL-4等的表达来调节Th1/Th2平衡,改善肾移植微环境,来预防排斥反应的发生。